¿Qué es HPLC (High Performance Liquid Chromatography)?
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es una técnica analítica para separar, identificar y cuantificar componentes en una mezcla. Es la técnica de cromatografía más usada y esencial en la mayoría de los laboratorios de todo el mundo.
La disminución del tamaño de partícula por debajo de 2.6 micras permite una mayor eficacia.
¿Cómo funciona la HPLC?
En cromatografía en columna, un eluyente percola a través de una columna llena con un adsorbente por gravedad. HPLC es una forma muy mejorada de cromatografía en columna. Una bomba fuerza el eluyente a través de una columna a altas presiones de hasta 400 atmósferas (hasta 1500 bar en UHPLC). El material de relleno de la columna o la fase adsorbente o estacionaria es típicamente un material granular hecho de partículas sólidas como sílice o polímeros.
La presión hace que la técnica sea mucho más rápida en comparación con la cromatografía en columna. Esta mayor velocidad permite utilizar partículas mucho más pequeñas para el material de relleno de la columna que tienen un área de superficie mucho mayor para las interacciones entre la fase estacionaria y las moléculas que transporta el eluyente. El resultado es una mayor separaciónr de los componentes de la mezcla.
El líquido presurizado es típicamente una mezcla de disolventes como agua, acetonitrilo y / o metanol y se denomina fase móvil.
Los componentes de una mezcla se separan gracias a sus diferentes grados de interacción con las partículas absorbentes causando diferentes velocidades de elución para cada componente y conduce a la separación de los componentes a medida que fluyen fuera de la columna. En comparación con la cromatografía en columna, HPLC es una técnica muy instrumental y extremadamente sensible.
Evolución de HPLC en paralelo con la evolución con la Purificación FLASH y la Cromatografía Preparativa.
Modos de HPLC
Las dos variantes más comunes son HPLC de Fase Normal y de Fase Inversa.
HPLC en Fase Normal
La columna está llena de diminutas partículas de sílice y se usa un disolvente no polar, por ejemplo, hexano. Una columna típica tiene un diámetro interno de 4,6 mm o menos y una longitud de 100 a 250 mm (en UHPLC las columnas suelen tener una longitud entre 30 y 100mm). El tamaño de partícula suele ser entre 10 y 3 µm en HPLC estándar (hasta 400 bar) y entre 1.9 y 1.5 µm en UHPLC (Hasta 1500 bar). Los compuestos no polares de la mezcla pasarán más rápidamente a través de la columna, ya que los polares se retienen más por la sílice polar que los compuestos no polares.
HPLC de Fase Inversa
El tamaño de la columna y partículas es el mismo. La columna está llena de partículas de sílice que se modifican para hacerlas no polares uniendo químicamente largas cadenas de hidrocarburos (de 8 a 18 átomos de C) a su superficie. En Fase Inversa se utiliza un disolvente polar, por ejemplo, una mezcla de agua y un alcohol como el metanol. Los compuestos polares de la mezcla pasarán más rápidamente a través de la columna porque se produce una fuerte atracción entre el disolvente polar y las moléculas polares de la mezcla.
Las moléculas no polares se ralentizan en su camino a través de la columna al formar diversos grados de interacción hidrofóbica y de dispersión de Van der Waals con los grupos de hidrocarburos. También son menos solubles en los componentes de la fase móvil acuosa, lo que facilita sus interacciones con los grupos apolares.
La HPLC de Fase Inversa es el modo HPLC más utilizado en los laboratorios de análisis.
Otros Modos de HPLC
Otras variantes más comunes en HPLC son Intercambio Iónico, Filtración de Gel, Afinidad e Interacción Hidrofóbica
HPLCde Intercambio Iónico (IC o IEXl
La Cromatografía por Intercambio Iónico (IC o IEX) separa proteínas en función de las diferencias de su carga superficial neta, y se basa en la interacción reversible entre una proteína cargada y un soporte cromatográfico con carga opuesta. Las proteínas se ligan al soporte en el momento de la inyección y se eluyen diferencialmente mediante un gradiente en el que se modifica la concentración de sales o el pH.
Volumen de muestra y capacidad
Para una separación óptima en elución por gradiente no supere el 20% de la capacidad total de la columna. Como IEX es una técnica de enlace no depende del volumen de la muestra.
Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y con el mismo pH y fuerza iónica del tampón inicial.
HPLC de Filtración de Gel (GF, SEC o GPC)
La Cromatografía por Filtración de Gel (GF, SEC o GPC) separa en función de las diferencias de tamaño molecular.
Puesto que la composición del tampón no afecta directamente la resolución, sus condiciones pueden adaptarse en función de la muestra o las necesidades de purificación siguientes.
Volumen de muestra y capacidad
Para una resolución máxima el volumen de muestra no debe superar el 5% del volumen total de la columna.
Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y se debe reducir su viscosidad por dilución si fuera necesario.
Muchos componentes de la muestra se unen a una columna HIC en una solución de alta fuerza iónica, típicamente Sulfato Amónico 1 a 2 M o NaCl 3 M. Las condiciones se alteran para que las sustancias ligadas eluyan diferencialmente. La elución se realiza generalmente disminuyendo la concentración de sal (disminución de fuerza iónica). Los cambios se realizan con un gradiente de sal decreciente continuo o también en etapas. Generalmente, las muestras se eluyen con un gradiente decreciente de Sulfato Amónico. Las proteínas objetivo se concentran en la fase inicial de la adsorción (inyección) y se recogen en forma purificada y concentrada.
HPLC de de Afinidad (AC)
En Cromatografía de Afinidad (AC) las moléculas se separan en base a una interacción reversible con un ligando específico unido a la fase cromatográfica.
El producto aanalizar se une específicamente y reversiblemente mediante un ligando específico. El material no ligado se eluye y la molécula ligada se recupera cambiando las condiciones: un ligando competitivo, el pH, la fuerza iónica o la polaridad.
Una variante interesante es la Cromatografía de Afinidad con Metal Inmobilizado (IMAC) en la que la interacción es entre proteínas con grupos funcionales histidina o marcadas con histidina e iones metálicos divalentes (Ni2+, Cu2+, Zn2+, Co2+) inmovilizados mediante un ligando quelante.
En este caso la columna IMAC se equilibra con un tampón con baja concentración de imidazol que se une al metal inmovilizado y se transforma en el contra-ligando.
La muestra se ajusta a la misma concentración de imidazol que el tampón ligante antes de su carga en la columna y ésta se lava con el tampón ligante. La elución se efectúa mediante un gradiente de imidazol hasta 100 o 500 mM o por etapas.
En la elución por gradiente se observan a menudo dos picos, uno previo a la proteina marcada con histidina que corresponde a proteinas del lisado que se unen de manera natural.
En la elución por etapas se observa un pico único de la proteína marcada con una pureza ligeramente menor que se puede repurificar con otro método adecuado.
Volumen de muestra y capacidad
Depende del medio usado y no depende del volumen de muestra.
Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y contaminarse que puedan ligarse a la columna.
GF es fácil de usar y permite la separación de sustancias con diferencias en tamaño molecular bajo condiciones blandas. GF también se llama cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), que describe más acertadamente el mecanismo de separación, o Cromatografía de Permeación de Gel (GPC). Todos se usan en la purificación de proteínas.
HPLC de Interacción Hidrofóbica (HIC)
La Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) separa moléculas en función de las diferencias de hidrofobicidad, y se basa en la interacción reversible de una molécula con la superficie hidrofóbica de la columna. La interacción se refuerza con tampones de elevada fuerza iónica y hacen de HIC el método ideal para separar proteínas obtenidas por precipitación con sulfato amónico o previamente separadas por IEX.
Volumen de muestra y capacidad
Para una resolución máxima el volumen de muestra no debe superar el 20% de la capacidad de enlace de la columna. HIC es una técnica de enlace y no depende del volumen de la muestra.
Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y se debe reducir su viscosidad por dilución si fuera necesario.
En AC, la proteína objetivo está unida de forma específica y reversible por una sustancia complementaria de unión (ligando). La muestra se aplica en condiciones que favorecen la unión específica al ligando El material no unido se elimina de la columna y se recupera la proteína objetivo cambiando a condiciones de elución. La elución se realiza específicamente, utilizando un ligando competitivo, o inespecíficamente, cambiando, por ejemplo, pH, fuerza iónica o polaridad. La proteína objetivo se eluye en forma purificada y concentrada.
Muchos componentes de la muestra se unen a una columna HIC en una solución de alta fuerza iónica, típicamente Sulfato Amónico 1 a 2 M o NaCl 3 M. Las condiciones se alteran para que las sustancias ligadas eluyan diferencialmente. La elución se realiza generalmente disminuyendo la concentración de sal (disminución de fuerza iónica). Los cambios se realizan con un gradiente de sal decreciente continuo o también en etapas. Generalmente, las muestras se eluyen con un gradiente decreciente de Sulfato Amónico. Las proteínas objetivo se concentran en la fase inicial de la adsorción (inyección) y se recogen en forma purificada y concentrada.
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