Equilibrado de Columnas

El equilibrado de las columnas FLASH: ¿es conveniente?

Las columnas FLASH, a diferencia de las columnas de HPLC analítica, se suministran con un alto grado de empaquetamiento con la fase sin activar (secas), con el fin de ofrecer un coste contenido con una buena garantía de reproducibilidad.

La activación antes del uso (con eluyentes adecuados si la columna es de Fase Normal o Inversa) es el proceso que en los Equipos PuriFLASH® de Interchim se denomina Equilibrado de de Columna, y consiste en activar la fase estacionaria pasando el eluyente inicial (normalmente Hexano, Heptano o equivalente en columnas de Fase Normal, o Agua con Orgánico en columnas de Fase Inversa) durante un tiempo y caudal que depende del tamaño de la columna.

Las columnas FLASH, ¿han de equilibrarse?

Muchos usuarios prefieren la técnica de inyección directa de la muestra a purificar en cabeza de la columna sin equilibrar (en seco) por los motivos que siguen:

• Ahorro de tiempo
• Ahorro de solvente
• Es un método que se ha recomendado anteriormente

La Tabla 1 muestra los tiempos de equilibrado recomendados para la Serie de Columnas FLASH PuriFLASH^® de Interchim.

Tabla 1. Tiempos de Equilibrado recomendados para las columnas PuriFLASH.

Un primer examen muestra que para las columnas grandes más usuales de tamaño de 120, 200  y 300g el equilibrado recomendado es de 3 CV. Como el volumen de estas columnas es de  para cada una de estas columnas es de 163, 292 y 440 mL respectivamente, se requerirán 480, 879 y 1.320 mL de eluyente respectivamente (el tiempo requerido está entre 6.9 y 10.4  minutos).

Es, por lo tanto, comprensible que muchos usuarios prefieran no equilibrar y proceder a una inyección en seco.

La Figura 1 muestra el proceso de equilibrado de una columna de 12g.

Figura 1. Equilibrado de columna

El Equilibrado es una operación necesaria

Para demostrar que el equilibrado de columnas es una operación ventajosa se ha procedido a inyectar un estándar de 250mg/mL de DMP (Dimetil Ftalato) y 250mg/mL de DEP (Dietil Ftalato) en una columna de Sílice PF-15SIHP/4G, tando en seco como tras equilibrado, en dos columnas de 4 g (50mg de DMP y 50 mg de DEP en columna).

Además para demostrar la estabilidad y reproducibilidad se han repetido diez veces la inyección en la misma columna PF-15SIHP/4G de 50mg de DMP y 50 mg de DEP.

En la Tabla 2 se muestran los valores de Resolución (Rs) entre los picos de DMP y DEP, los Tiempos de Retención (TR1, TR2) y los valores de Simetría (S1, S2) así como la deviación estándar.

Tabla 2. Valores de Resolución, Retención y Simetría tras 10 inyecciones en la misma columna.

N1 y N2 muestran los valores en dos columnas nuevas de 4 g y la Figura 2 muestra el cromatograma de la purificación resultante.

Figura 2. Purificación de DMP y DEP en una columna nueva tras equilibrado.

La Figura 3 muestra el resultado obtenido mediante inyección en seco. Como se puede notar el resultado no resulta satisfactorio para la primera zona de la purificación.

Figura 3. Purificación de DMP y DEP inyectados en seco en cabeza de columna.

La Figura 4 es una superposición de las purificaciones con columna equilibrada y en seco mostrando la pérdida severa de resolución y la creación de artefactos en la inyección en seco.

Figura 4. Purificación en columna equilibrada y en columna seca.

Conclusión

Aunque la inyección en seco sea un método de introducción de muestra que pueda tener ventajas en lo que respecta a la velocidad de análisis y en el ahorro de eluyentes, los resultados pueden ser contraproducentes al crearse artefactos potenciales y pérdida de resolución especialmente en los compuestos de elución temprana.