Proteínas y Péptidos

La Cromatografía por Interacción Hidrofóbica (HIC) separa proteínas en función de las diferencias de hidrofobicidad, y se basa en la interacción reversible de una proteína con la superficie hidrofóbica de la columna. La interacción se refuerza con tampones de elevada fuerza iónica y hacen de HIC el método ideal para separar proteínas obtenidas por precipitación con sulfato amónico o previamente separadas por IEX.

Volumen de muestra y capacidad
Para una resolución máxima el volumen de muestra no debe superar el 20% de la capacidad de enlace de la columna. HIC es una técnica de enlace y no depende del volumen de la muestra.

Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y con el mismo pH del tampón inicial y con alta fuerza iónica.

Tampones
Si desconoce la hidrofobicidad de su proteína pruebe estas condiciones

Tampón Inicial (A): 50 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O pH 7.0 + 1.0 M Sulfato Amónico
Tampón Eluyente (B): 50 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O pH 7.0
Gradiente: 0-100% B en 10-20 CV

Cómo optimizar el método

• Seleccione un gradiente para una separación aceptable.
• Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación.
• Para purificaciones en gran escala pruebe un gradiente por etapas.
• Las especies que adsorban fuertemente en un medio se eluyen más fácilmente cambiando a una fase menos hidrofóbica.

La Cromatografía de Fase Inversa (RPC)) separa proteínas en función de las diferencias de hidrofobicidad, y se basa en la interacción reversible entre una proteína cargada y un soporte cromatográfico hidrofóbico. Las proteínas se ligan al soporte en el momento de la inyección y, puesto que el enlace proteína – fase estacionaria suele ser muy fuerte, se eluyen diferencialmente mediante un gradiente en el que se aumenta la concentración de solvente orgánico, normalmente acetonitrilo.
RPC se usa muchas veces como método de purificación final de oligonucleótidos y péptidos, y resulta ideal en aplicaciones analíticas como la generación de mapas de péptidos.
Sin embargo RPC no es recomendable si se quiere mantener la actividad o la estructura terciaria de la proteína puesto que muchas se desnaturalizan en presencia de solventes orgánicos.

Volumen de muestra y capacidad
La capacidad total depende mucho de las condiciones experimentales y de las propiedades de la fase y de la muestra. Para una separación óptima en elución por gradiente seleccione una carga que no afecte a la resolución de la columna. Como RPC es una técnica de enlace no depende del volumen de la muestra.

Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y disueltas en el eluyente inicial. Si son insolubles puede probar (pruebe antes con una fracción de la muestra, un péptido muy hidrofóbico puede precipitar o ligarse irreversiblemente a la fase):

• Ácido Acético 10-30%
• Ácido Fórmico 70%
• Guanidina HCl 6M
• DMSO 100%. 
• TFA

Tampones
Si desconoce las características de su proteína pruebe estas condiciones:

Eluyente Inicial (A): 0.1% TFA en 5% ACN
Eluyente (B): 0.1% TFA en 80% ACN
Gradiente: 0-100% B en 20 CV

Cómo optimizar el método

• Seleccione la fase óptima mediante pruebas con diferentes columnas.
• Seleccione el gradiente más pronunciado para obtener una resolución aceptable. Use 0-100% B en muestras desconocidas.
• Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación.
• Para purificaciones en gran escala pruebe un gradiente por etapas
• Las muestras que adsorban fuertemente en una fase se eluyen más fácilmente en una fase menos hidrofóbica.

La Cromatografía por Intercambio Iónico (IC o IEX)) separa proteínas en función de las diferencias de su carga superficial neta, y se basa en la interacción reversible entre una proteína cargada y un soporte cromatográfico con carga opuesta. Las proteínas se ligan al soporte en el momento de la inyección y se eluyen diferencialmente mediante un gradiente en el que se modifica la concentración de sales o el pH. 

Volumen de muestra y capacidad
Para una separación óptima en elución por gradiente no supere el 20% de la capacidad total de la columna. Como IEX es una técnica de enlace no depende del volumen de la muestra.

Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y con el mismo pH y fuerza iónica del tampón inicial.

Tampones
Si desconoce las características de carga de su proteína pruebe estas condiciones

Intercabio Aniónico
Tampón Inicial (A): 20 mM Tris-HCl, pH 7.4
Tampón Eluyente (B): 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 + 1 M NaCl pH 7.4
Gradiente: 0-100% B en 10-20 CV
Intercambio Catiónico
Tampón Inicial (A): 20 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O, pH 6.8
Tampón Eluyente (B): 20 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O + 1 M NaCl pH 6.8
Gradiente: 0-100% B en 10-20 CV

Cómo optimizar el método

Seleccione el intercambiador iónico óptimo.
Seleccione el pH óptimo.
Seleccione el gradiente más pronunciado para obtener una resolución aceptable al pH seleccionado.
Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación.
Para purificaciones en gran escala pruebe un gradiente por etapas para reducir los tiempos de separación y el consumo de tampones.