¿Qué es la Purificación de Péptidos y Proteínas?
La purificación de proteínas se realiza a escala laboratorio (microgramos y miligramos) o nivel industrial (kilogramos a toneladas).
Los métodos más comunes para la purificación preparativa de proteínas son cromatográficos que separan según las diferencias entre las propiedades de la proteína a purificar (la proteína objetivo) y las propiedades de otras sustancias en la muestra.
En algunos laboratorios las proteínas se purifican en paralelo, utilizando sistemas de cromatografía automatizados.
Los métodos cromatográficos más usados son, por ejemplo, la Filtración de Gel (GF, SEC o GPC), el Intercambio Iónico (IEX o IC), la Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) y la Cromatografía de Fase Inversa (RPC).
Todos los equipos de la serie P de Interchim® como 5.250P o PF UP3 han sido diseñados y optimizados para operar con todas esas técnicas y con todas las biocolumnas de separación más usuales.
Cromatografía de Afinidad (AC)
Alta Resolución – Alta Capacidad
En Cromatografía de Afinidad (AC) las proteínas se separan en base a una interacción reversible entre la proteína y un ligando específico unido a la fase cromatográfica.
La proteína a purificar se une específicamente y reversiblemente mediante un ligando específico. El material no ligado se eluye y la proteína ligada se recupera cambiando las condiciones: un ligando competitivo, el pH, la fuerza iónica o la polaridad.
Una variante interesante es la Cromatografía de Afinidad con Metal Inmobilizado (IMAC) en la que la interacción es entre proteínas con grupos funcionales histidina o marcadas con histidina e iones metálicos divalentes (Ni2+, Cu2+, Zn2+, Co2+) inmovilizados mediante un ligando quelante.
En este caso la columna IMAC se equilibra con un tampón con baja concentración de imidazol que se une al metal inmovilizado y se transforma en el contra-ligando.
La muestra se ajusta a la misma concentración de imidazol que el tampón ligante antes de su carga en la columna y ésta se lava con el tampón ligante. La elución se efectúa mediante un gradiente de imidazol hasta 100 o 500 mM o por etapas.
En la elución por gradiente se observan a menudo dos picos, uno previo a la proteina marcada con histidina que corresponde a proteinas del lisado que se unen de manera natural.
En la elución por etapas se observa un pico único de la proteína marcada con una pureza ligeramente menor que se puede repurificar con otro método adecuado.
Volumen de muestra y capacidad
Depende del medio usado y no depende del volumen de muestra.
Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y contaminarse que puedan ligarse a la columna.
Tampones
Los tampones de ligando, elución y regeneración son específicos para cada fase.
Cómo optimizar el método
- Seleccione el medio específico para la proteína
- Seleccione el caudal óptimo para una unión «binding» eficaz
- Seleccione el caudal óptimo para obtener la máxima recuperación
- Seleccione el caudal óptimo de regeneración para minimizar la duración del método.
En AC, la proteína objetivo está unida de forma específica y reversible por una sustancia complementaria de unión (ligando). La muestra se aplica en condiciones que favorecen la unión específica al ligando El material no unido se elimina de la columna y se recupera la proteína objetivo cambiando a condiciones de elución. La elución se realiza específicamente, utilizando un ligando competitivo, o inespecíficamente, cambiando, por ejemplo, pH, fuerza iónica o polaridad. La proteína objetivo se eluye en forma purificada y concentrada.
Cromatografía de Filtración de Gel (GF, SEC o GPC)
Alta Resolución
La Cromatografía por Filtración de Gel (GF, SEC o GPC) separa proteínas en función de las diferencias de tamaño molecular.
Puesto que la composición del tampón no afecta directamente la resolución, sus condiciones pueden adaptarse en función de la muestra o las necesidades de purificación siguientes.
Volumen de muestra y capacidad
Para una resolución máxima el volumen de muestra no debe superar el 5% del volumen total de la columna.
Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y se debe reducir su viscosidad por dilución si fuera necesario.
Tampones
Seleccione un tampón compatible con la estabilidad de su proteína con una fuerza iónica equivalente a 150 mM NaCl, como mínimo
Cómo optimizar el método
- Seleccione el medio con su proteína en el centro de su rango de separación.
- Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación. Un flujo bajo mejora la resolución de componentes de alto PM y viceversa.
- Determine el volumen máximo de muestra sin pérdida de resolución (normalmente el 0.5-5% del volumen de columna).
- Aumente la resolución disponiendo columnas en serie.
GF es fácil de usar y permite la separación de sustancias con diferencias en tamaño molecular bajo condiciones blandas. GF también se llama cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), que describe más acertadamente el mecanismo de separación, o Cromatografía de Permeación de Gel (GPC). Todos se usan en la purificación de proteínas.
Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)
Buena Resolución – Buena Capacidad
La Cromatografía por Interacción Hidrofóbica (HIC) separa proteínas en función de las diferencias de hidrofobicidad, y se basa en la interacción reversible de una proteína con la superficie hidrofóbica de la columna. La interacción se refuerza con tampones de elevada fuerza iónica y hacen de HIC el método ideal para separar proteínas obtenidas por precipitación con sulfato amónico o previamente separadas por IEX.
Volumen de muestra y capacidad
Para una resolución máxima el volumen de muestra no debe superar el 20% de la capacidad de enlace de la columna. HIC es una técnica de enlace y no depende del volumen de la muestra.
Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y con el mismo pH del tampón inicial y con alta fuerza iónica.
Tampones
Si desconoce la hidrofobicidad de su proteína pruebe estas condiciones
Tampón Inicial (A): 50 mM Na2HPO4 x 2H2O pH 7.0 + 1.0 M Sulfato Amónico
Tampón Eluyente (B): 50 mM Na2HPO4 x 2H2O pH 7.0
Gradiente: 0-100% B en 10-20 CV
Cómo optimizar el método
- Seleccione un gradiente para una separación aceptable.
- Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación.
- Para purificaciones en gran escala pruebe un gradiente por etapas.
- Las especies que adsorban fuertemente en un medio se eluyen más fácilmente cambiando a una fase menos hidrofóbica.
Muchos componentes de la muestra se unen a una columna HIC en una solución de alta fuerza iónica, típicamente Sulfato Amónico 1 a 2 M o NaCl 3 M. Las condiciones se alteran para que las sustancias ligadas eluyan diferencialmente. La elución se realiza generalmente disminuyendo la concentración de sal (disminución de fuerza iónica). Los cambios se realizan con un gradiente de sal decreciente continuo o también en etapas. Generalmente, las muestras se eluyen con un gradiente decreciente de Sulfato Amónico. Las proteínas objetivo se concentran en la fase inicial de la adsorción (inyección) y se recogen en forma purificada y concentrada.
Cromatografía de Fase Inversa (RPC)
Alta Resolución
La Cromatografía de Fase Inversa (RPC)) separa proteínas en función de las diferencias de hidrofobicidad, y se basa en la interacción reversible entre una proteína cargada y un soporte cromatográfico hidrofóbico. Las proteínas se ligan al soporte en el momento de la inyección y, puesto que el enlace proteína – fase estacionaria suele ser muy fuerte, se eluyen diferencialmente mediante un gradiente en el que se aumenta la concentración de solvente orgánico, normalmente acetonitrilo.
RPC se usa muchas veces como método de purificación final de oligonucleótidos y péptidos, y resulta ideal en aplicaciones analíticas como la generación de mapas de péptidos.
Sin embargo RPC no es recomendable si se quiere mantener la actividad o la estructura terciaria de la proteína puesto que muchas se desnaturalizan en presencia de solventes orgánicos.
Volumen de muestra y capacidad
La capacidad total depende mucho de las condiciones experimentales y de las propiedades de la fase y de la muestra. Para una separación óptima en elución por gradiente seleccione una carga que no afecte a la resolución de la columna. Como RPC es una técnica de enlace no depende del volumen de la muestra.
Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y disueltas en el eluyente inicial. Si son insolubles puede probar (pruebe antes con una fracción de la muestra, un péptido muy hidrofóbico puede precipitar o ligarse irreversiblemente a la fase):
- Ácido Acético 10-30%
- Ácido Fórmico 70%
- Guanidina HCl 6M
- DMSO 100%.
- TFA
Tampones
Si desconoce las características de su proteína pruebe estas condiciones:
Eluyente Inicial (A): 0.1% TFA en 5% ACN
Eluyente (B): 0.1% TFA en 80% ACN
Gradiente: 0-100% B en 20 CV
Cómo optimizar el método
- Seleccione la fase óptima mediante pruebas con diferentes columnas.
- Seleccione el gradiente más pronunciado para obtener una resolución aceptable. Use 0-100% B en muestras desconocidas.
- Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación.
- Para purificaciones en gran escala pruebe un gradiente por etapas
- Las muestras que adsorban fuertemente en una fase se eluyen más fácilmente en una fase menos hidrofóbica.
Las proteínas se ligan al soporte en el momento de la inyección y, puesto que el enlace proteína – fase estacionaria suele ser muy fuerte, se eluyen diferencialmente mediante un gradiente en el que se aumenta la concentración de solvente orgánico, normalmente acetonitrilo.
La fuerza de enlace puede modularse con aditivos (par iónico) o con solventes como Metanol, Etanol y propanol.
¡Use RPC si sus proteínas son estables en los solventes orgánicos usado!
Cromatografía de Intercambio Iónico (IC, IEX)
Alta Resolución – Alta Capacidad
La Cromatografía por Intercambio Iónico (IC o IEX)) separa proteínas en función de las diferencias de su carga superficial neta, y se basa en la interacción reversible entre una proteína cargada y un soporte cromatográfico con carga opuesta. Las proteínas se ligan al soporte en el momento de la inyección y se eluyen diferencialmente mediante un gradiente en el que se modifica la concentración de sales o el pH.
Volumen de muestra y capacidad
Para una separación óptima en elución por gradiente no supere el 20% de la capacidad total de la columna. Como IEX es una técnica de enlace no depende del volumen de la muestra.
Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y con el mismo pH y fuerza iónica del tampón inicial.
Tampones
Si desconoce las características de carga de su proteína pruebe estas condiciones
Intercabio Aniónico
Tampón Inicial (A): 20 mM Tris-HCl, pH 7.4
Tampón Eluyente (B): 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 + 1 M NaCl pH 7.4
Gradiente: 0-100% B en 10-20 CV
Intercambio Catiónico
Tampón Inicial (A): 20 mM Na2HPO4 x 2H2O, pH 6.8
Tampón Eluyente (B): 20 mM Na2HPO4 x 2H2O + 1 M NaCl pH 6.8
Gradiente: 0-100% B en 10-20 CV
Cómo optimizar el método
Seleccione el intercambiador iónico óptimo.
Seleccione el pH óptimo.
Seleccione el gradiente más pronunciado para obtener una resolución aceptable al pH seleccionado.
Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación.
Para purificaciones en gran escala pruebe un gradiente por etapas para reducir los tiempos de separación y el consumo de tampones.
Muchos componentes de la muestra se unen a una columna IEX en una solución de alta fuerza iónica, típicamente Sulfato Amónico 1 a 2 M o NaCl 3 M. Las condiciones se alteran para que las sustancias ligadas eluyan diferencialmente. La elución se realiza generalmente disminuyendo la concentración de sal (disminución de fuerza iónica). Los cambios se realizan con un gradiente de sal decreciente continuo o también en etapas. Generalmente, las muestras se eluyen con un gradiente decreciente de Sulfato Amónico. Las proteínas objetivo se concentran en la fase inicial de la adsorción (inyección) y se recogen en forma purificada y concentrada.
Instrumentación
En 2018 han sido presentados los equipos puriFlash™ de la familia Gen5 de la Serie Péptidos que tiene en cuanta las exigencias más estrictas requeridas en la purificación de Péptidos y Proteínas.
- puriFlash™ PF 5.250P para purificaciones a escala laboratorio, con capacidad plena para columnas de 5 um hasta 80mm D.I. y a una fracción del coste de un equipo para cromatografía preparativa tradicional.
En 2022 se presentará puriFlash PF UP3 (Ultra Performance Protein Purification) que abre nuevos horizontes en el desarrollo de métodos y purificación de proteínas, que es compatible 100% con cualquier columnas existente de GF, IEX y AC y biocolumnas de Baja y Media Presión.
Además del sistema estándar de detección basado en Detectores UV-Vis DAD, Interchim dispone de Detectores iELSD, Conductividad y el nuevo MSD Cuadropular Ultra Compacto especialmente adaptado para Cromatografía FLASH y Preparativa.
Serie puriFlash® PF 5.250P
Purificación de Mezclas Complejas de Péptidos
Máxima eficacia: el uso de partículas pequeñas en combinación con una fluídica específica, hacen que PF 5.250P permita discriminar péptidos cercanos en términos de secuencia de aminoácidos.
Serie puriFlash® PF UP3
UP3 – Ultra Performance Proteins Purification
UP3 abre nuevos horizontes en el desarrollo de métodos y purificación de proteínas.
Un único instrumento, de fácil uso, que ofrece más capacidades y flexibilidad ahorrando tiempo. Compatible con el 100% de las Biocolumnas existentes de SEC, IEX y AC, tanto de baja como de media presión.
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