¿Qué es la Cromatografía FLASH?
La Cromatografía FLASH es un método de purificación de compuestos de síntesis que se basa en Cromatografía de Líquidos de Media Presión, a diferencia de los sistemas tradicionales por gravedad en columna que son mucho más lentos e ineficientes.
La Cromatografía FLASH difiere de la cromatografía tradicional en columna básicamente por el mayor tamaño de las partículas del soporte, y en la menor pérdida de carga generada que no obliga al uso de una fuente de presión para generar el caudal de fase móvil necesario en columna.
Sin embargo, de la misma manera que la Cromatografía de Líquidos ha ido evolucionando, la Purificación FLASH ha seguido un camino paralelo.
El resultado final en una separación rápida (FLASH) y de alta resolución.
Evolución de la Purificación FLASH en paralelo con la evolución de la Cromatografía de Líquidos.
¿Qué es Ultra Performace Flash Purificacion (UPFP)?
La UPFP se basa en dos conceptos:
1. Uso de Columnas FLASH de Alta Eficacia y Empacado optimizado
2. Equipos FLASH con bombas de media y alta Presión (de 15 a 250 bar) y altos caudales estables (200-250 mL/min con H2O o IPA)
La disminución del tamaño de partícula y el uso de fases esféricas permite una mayor eficacia y velocidad.
El ejemplo muestra la separación de una mezcla de dietil y dimetil ftalato en condiciones isocráticas (hexano/etil acetato 85:15). A un caudal de 30 mL/min la contrapresión generada por las columnas de 50, 30 y 15 μm es respectivamente de 0.34, 1.03 y 6.5 bar.
El resultado es un aumento de la pureza y velocidad al disminuir el tamaño de la partícula de la columna (PF-15SIHP/12G de 15 μm).
Eluyentes
La Cromatografía FLASH es una evolución de la cromatografía en columna que todavía es de uso general en los laboratorios de síntesis orgánica.
En general el compuesto de interés, separado por TLC, ha de tener un con el soporte y fase móvil seleccionada. La fase móvil usualmente es binaria con uno de los dos solventes de mayor polaridad para permitir ajustar fácilmente la polaridad media y optimizar la separación.
En FLASH la fase estacionaria más usada es gel de sílice por lo que al aumentar la polaridad del solvente aumenta la velocidad de elución de todos los componentes de la mezcla. Las fases móviles binarias de polaridad creciente más usuales son cloruro de metileno/hexano, éter etílico/hexano, hexano/etil acetato y cloruro de metileno/metanol. Estas fases móviles, excepto hexano/etil acetato, obligan a trabajar en campana de seguridad.
En general si Rf ~0.2 será necesario usar un volumen de solvente equivalente a 5 veces el volumen del lecho de la columna para completar la separación.
En FLASH instrumental las mezclas pueden ser más complejas: los instrumentos de la serie puriFlash permiten el control de hasta cuatro eluyentes diferentes y el potente software InterSoft® X permite que el rango óptimo de Rf en la placa TLC se amplíe hasta Rf de 0.08 a 0.40.
Separación en gradiente con partícula de 50 y 30 μm y condiciones optimizadas.
El ejemplo muestra de nuevo la separación de una mezcla de dietil y dimetil ftalato en condiciones de gradiente (hexano:etil acetato 100:0 a 85:15 en 7′ + 13′) y gradiente optimizado.
A un caudal de 30 mL/min la contrapresión generada por las columnas de 50, 30 y 15 mm es respectivamente de 0.34, 1.03 y 16.5 bar.
Estas prestaciones sólo se pueden conseguir con equipos FLASH de segunda generación como puriFlash™ XS 520, PF 5.050, en con los Sistemas Híbridos PF 5.125 o PF 5.250.
Masa de Fase o de Lecho
La cantidad de fase en la columna necesaria para una buena separación depende la diferencia de Rf entre los compuestos a separar, de su cantidad, de la geometría de la fase y de su empaquetado.
En general por cada gramo de producto se requiere entre 30 y 100g de soporte en una columna tradicional. En las columnas especialmente diseñadas y empacadas para FLASH la capacidad de carga puede expresarse como un porcentaje de la masa de soporte: por ejemplo la serie puriFlash HC de SiO2 esférica de 50 µm de Interchim puede soportar ¡hasta el 20% de la masa de soporte en producto!
La capacidad de carga de una columna FLASH depende de la masa del lecho disponible.
Una columna tradicional por gravedad de gel de sílice de 40g, en el mejor de los casos tiene una capacidad de carga de 1.35g.
Una columna PF-50SIHC/40 de 40g puede admitir ¡hasta 8g de producto!
Empacado de la columna
Uno de los mayores problemas en la cromatografía FLASH instrumental surge de la calidad de la fase y del empacado de la columna.
Una columna mediocremente realizada o empacada con fases de granulometría dispersa genera una menor reproducibilidad que la que se obtiene con partículas perfectamente caracterizadas lote a lote y procedimientos de empacado desarrollados en la producción de columnas analíticas y semipreparativas de alta calidad.
Interchim no solo es uno de los mayores fabricantes de columnas de HPLC sino que además produce soportes con tecnología propia y estrictos controles de calidad, que aplica en la producción de columnas FLASH para garantizar la máxima calidad y prestaciones constantes lote a lote.
El ejemplo muestra la diferencia en prestaciones entre una columna FLASH económica y la columna equivalente PF-50SIHP/40G: no sólo la eficacia es superior a caudal equivalente sino que, además, el consumo de eluyente se reduce en un 30%.
Usando columnas de menor tamaño de partícula la velocidad de la separación aumenta en un factor 3X.
Usando columnas de menor tamaño de partícula y equipos FLASH de última generación, la velocidad de la separación aumenta ¡en un factor de 3X!.
Instrumentación
La instrumentación necesaria en cromatografía FLASH puede ser tan simple como una bomba isocrática combinada con una columna FLASH tipo PF-50SIHC/40, o un sofisticado sistema (ver puriFlash™ XS 520 o puriFlash™ PF 5.020) dotado de una bomba cuaternaria y generador de gradientes hasta 250 mL/min y 250 bar, detector UV con software de detección automática de picos, colector de hasta 176 fracciones, y capacidad de operar con columnas de 2.5g a 1.2Kg que permiten purificar desde 0.5 g hasta 240 g de producto.
La ventaja de operar a mayores presiones que los instrumentos actualmente disponibles es tan grande como ¡multiplicar X3 la velocidad de análisis o reducir un 30% el uso de eluyentes!.
Para aplicaciones de gran tamaño puriFlash™ XS 535 XL o puriFlash™ PF 5.015 XL son las soluciones ideales y, para aquellos usuarios con presupuesto limitado pero que quieran obtener las ventajas de la UPFP, el modelo puriFlash™ XS 520 Plus cumplirá con las expectativas de las purificaciones más exigentes.
En 2018 han sido presentados los equipos puriFlash™ de la familia Gen5 como PF 5.125 que, demás de ofrecer prestaciones UPFP permite LC-PREP con columnas estándar hasta 10 μm, y el modelo puriFlash™ PF 5.250 para purificaciones a escala laboratorio, con capacidad plena para columnas de 5 um hasta 80mm D.I. y a una fracción del coste de un equipo para cromatografía preparativa tradicional.
Además del sistema estándar de detección basado en Detectores UV-Vis DAD, Interchim dispone de Detectores iELSD y el nuevo MSD Cuadropular Ultra Compacto especialmente adaptado para Cromatografía FLASH y Preparativa.
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