¿Qué es la Cromatografía Preparativa y la Ultra-Preparativa?
LCPrep se basa en dos conceptos:
1. Uso de las mismas columnas de Alta Eficacia usadas en HPLC pero con la geometría adecuada para poder soportar altas cargas de muestra.
2. Equipos LCPrep con bombas de media y alta Presión (de 50 a 400 bar) y altos caudales estables (200-250 mL/min con H2O o IPA)
UPrep se basa en conceptos similares:
1. Uso de las mismas columnas de Alta Eficacia usadas en UHPLC (tamaño de partícula sub 2.6 um) pero con la geometría adecuada para poder soportar altas cargas de muestra.
2. Equipos LCPrep con bombas alta Presión y caudal (PF 5.400, 400bar y 125 mL/min)
La disminución del tamaño de partícula por debajo de 2.6 micras permite una mayor eficacia.
Objetivos de la Cromatografía Preparativa
HPLC y LCPrep difieren en los objetivos de cada técnica.
En LCPrep el objetivo principal es purificar y colectar sus moléculas de interés del resto de los otros componentes de una mezcla para su uso posterior.
En HPLC el objetivo es identificar y cuantificar los componentes de una mezcla.
Estos diferentes objetivos obligan a algunas diferencias instrumentales entre las dos técnicas: en LCPrep, el volumen de muestra es importante y se requiere un colector para recuperar las muestras en un rango de algunos miligramos a varios gramos con alto rendimiento, mientras que en HPLC los eluidos de la columnas se llevan directamente al depósito de residuos o a detectores «destructivos» como MS, ELSD o CAD (que pueden también ser utilizados en LCPrep con la ayuda de divisores de muestra adecuados).
La Cromatografía FLASH difiere de la cromatografía LCPrep en el tipo de columna: básicamente por el mayor tamaño de las partículas del soporte, y en la menor pérdida de carga generada que no obliga al uso de una fuente de presión tan alta como en LCPrep sacrificando resolución para ganar velocidad.
Sin embargo, de la misma manera que la Cromatografía de Líquidos ha ido evolucionando, la Cromatografía de Líquidos Preparativa y la Purificación FLASH han seguido caminos paralelos.
El resultado final en una separación rápida (FLASH) o de alta resolución (LCPrep).
Evolución de la Purificación FLASH en paralelo con la evolución de la Cromatografía de Líquidos y la Cromatografía Preparativa.
¿Por qué en Cromatografía Preparativa y Ultra-Preparativa se requieren altos caudales y presiones?
LCPrep se basa básicamente en purificaciones en Fase Inversa:
1. El uso de las mismas columnas usadas en HPLC con eluyentes acuosos requiere una combinación caudal/presión que puede limitar el alcance de la Técnica
2. Los equipos LCPrep con bombas de baja presión (50 bar, 250 mL/min) obligan al uso de columnas con tamaño de partícula no inferior a 10 micras. Resultado: eficacia y capacidad medias.
3. Los equipos LCPrep con bombas de media presión (125 bar, 250 mL/min) permiten el uso de columnas con tamaño de partícula de 5 micras y D.I. limitado. Resultado: eficacia y capacidad buenas.
4. Los equipos LCPrep con bombas de alta presión (250 bar, 250 mL/min) permiten el uso de columnas con tamaño de partícula de 5 micras y gran D.I. Resultado: eficacia y capacidad excelentes.
UPrep se basa en conceptos similares pero usando Columnas de Interacción Superficial o de partículas sub 2.6 micras. Se requieren muy altas presiones y su uso se aplica a separaciones extremadamente difíciles donde se prime la resolución a la capacidad (400bar, 125 mL/min)
El gráfico muestra las limitaciones debidas a las características de las bombas de los Equipos Híbridos PF 5.050, PF 5.125 y PF 5.250 y del equipo para UPREP 5.400.
El Compromiso entre Caudal, Presión y Geometría de la Columna
La Cromatografía FLASH es una evolución de la cromatografía en columna que todavía es de uso general en los laboratorios de síntesis orgánica.
En general el compuesto de interés, separado por TLC, ha de tener una retención mínima con el soporte y fase móvil seleccionada. La fase móvil usualmente es binaria con uno de los dos solventes de mayor polaridad para permitir ajustar fácilmente la polaridad media y optimizar la separación.
En FLASH la fase estacionaria más usada es gel de sílice por lo que al aumentar la polaridad del solvente aumenta la velocidad de elución de todos los componentes de la mezcla. Las fases móviles binarias de polaridad creciente más usuales son cloruro de metileno/hexano, éter etílico/hexano, hexano/etil acetato y cloruro de metileno/metanol. Estas fases móviles, excepto hexano/etil acetato, obligan a trabajar en campana de seguridad.
En general si Rf ~0.2 será necesario usar un volumen de solvente equivalente a 5 veces el volumen del lecho de la columna para completar la separación.
En FLASH instrumental las mezclas pueden ser más complejas: los instrumentos de la serie puriFlash permiten el control de hasta cuatro eluyentes diferentes y el potente software InterSoft® X permite que el rango óptimo de Rf en la placa TLC se amplíe hasta Rf de 0.08 a 0.40.
Separación en gradiente con partícula de 50, 30 y 15 μm y condiciones optimizadas.
El ejemplo muestra de nuevo la separación de una mezcla de dietil y dimetil ftalato en condiciones de gradiente (hexano : etil acetato 100:0 a 85:15 en 7′ + 13′) y gradiente optimizado.
A un caudal de 30 mL/min la contrapresión generada por las columnas de 50, 30 y 15 mm es respectivamente de 0.34, 1.03 y 16.5 bar.
Estas prestaciones sólo se pueden conseguir con equipos FLASH de segunda generación como puriFlash™ XS 520, PF 5.050, o con los Sistemas Híbridos PF 5.125 o PF 5.250.
Caudales requeridos para una separación en función del diámetro de la columna. Dependiendo de la Técnica de Separación y de los Eluyentes utilizados, la bomba deberá generar la presión adecuada.
Transferencia de métodos desde HPLC a Preparativa
Transferir un Método desarrollado en HPLC a LCPrep no es demasiado complicado: el Software InterSoft® X «Genius» de serie en los equipos puriFlash® permite la transposición automática.
Manualmente se han de seguir tres pasos:
1. Cálculo del Caudal a aplicar en la columna preparativa
2. Cálculo del Volumen a inyectar en la columna preparativa
3. Cálculo de las nuevas Condiciones de Gradiente
En este caso la columna preparativa de 30 mm D.I. ha sido empacada con partículas de mayor diámetro que las de la columna analítica de 4.6 mm D.I. (15 y 5 μm respectivamente): el caudal necesario es de 10.63 mL/min.
Si la columna LCPrep tuviera el mismo tamaño de partícula que el de la columna HPLC (5 μm) el caudal requerido sería de 31.9 mL/min.
El volumen de muestra inyectada no depende del tamaño de la partícula y depende de la geometría de la columna (L y D.I.): el volumen necesario es de 212.67 μL.
Si la columna LCPrep fuera de 30 x 100 mm el volumen de muestra sería de 85.7 μL, y si la geometría fuera 50 x 250 mm el volumen a inyectar sería de 590,74 μL,
El ajuste de la etapa isocrática del gradiente no depende del tamaño de la partícula y depende de la longitud de la columna (L y D.I.): el nuevo tiempo necesario pasa de 3 a 9 minutos.
Si la columna LCPrep fuera de 100 mm el tiempo sería menor: 3.6 minutos.
El ejemplo muestra el resultado de la transferencia de un método HPLC (con fase de interacción superficial de 250 x 4.6 mm y 1.7 μm) a una columna LCPrep de 21.2 x 150 mm y 15 μm en un único equipo PF 5.400.
Instrumentación
La instrumentación necesaria en cromatografía FLASH puede ser tan simple como una bomba isocrática combinada con una columna FLASH tipo PF-50SIHC/40, o un sofisticado sistema (ver puriFlash™ XS 520 o puriFlash™ PF 5.020) dotado de una bomba cuaternaria y generador de gradientes hasta 250 mL/min y 250 bar, detector UV con software de detección automática de picos, colector de hasta 176 fracciones, y capacidad de operar con columnas de 2.5g a 1.2Kg que permiten purificar desde 0.5 g hasta 240 g de producto.
La ventaja de operar a mayores presiones que los instrumentos actualmente disponibles es tan grande como ¡multiplicar X3 la velocidad de análisis o reducir un 30% el uso de eluyentes!.
Para aplicaciones de gran escala puriFlash™ XS 535 XL o puriFlash™ PF 5.015 XL son las soluciones ideales y, para aquellos usuarios con presupuesto limitado pero que quieran obtener las ventajas de la UPFP, el modelo puriFlash™ XS 520 Plus cumplirá con las expectativas de las purificaciones más exigentes.
En 2018 se presentaron los equipos puriFlash™ de la familia Gen5 como PF 5.125 que, demás de ofrecer prestaciones UPFP permite LC-PREP con columnas estándar hasta 10 μm, y el modelo puriFlash™ PF 5.250 para purificaciones a escala laboratorio, con capacidad plena para columnas de 5 um y hasta 80 mm D.I. y a una fracción del coste de un equipo para cromatografía preparativa tradicional.
Además del sistema estándar de detección basado en Detectores UV-Vis DAD, Interchim dispone de Detectores iELSD y el nuevo MSD Cuadropular Ultra Compacto especialmente adaptado para Cromatografía FLASH y Preparativa.
CROMLAB – INSTRUMENTS le ofrece los equipos más avanzados en Cromatografía FLASH
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