S-BLIS

Los aminoácidos (AA) son compuestos muy polares y su separación normalmente se realiza en modo intercambio iónico.

A un pH neutro, la mayoría de los AA naturales y sintéticos esencialmente no están cargados si tienen la misma cantidad de grupos funcionales ácidos y básicos en la molécula.

Cuando se utiliza el mecanismo de intercambio iónico, la separación de iones requiere una alta concentración de tampones en la fase móvil.

Dado que los AA no están cargados en soluciones no tamponadas, se requiere un ácido o una base para convertir esta molécula zwitteriónica en una forma cargada (ver Fig. 1).

Figura 1: Estados de carga de los AA’s a diferente pH

Este ácido o base suele ser un componente de la fase móvil.

Sin embargo, si la fase estacionaria tiene incorporados grupos funcionales ácidos o básicos, puede proporcionar la ionización necesaria para los zwitteriones.

La columna Primesep 200 es una columna de fase inversa con grupos funcionales ácidos incrustados (Fig. 2).

Figura 2: Estructura simplificada de la Fase Primesep 200. El ligando unido al soporte de sílica y el grupo ácido incrustado está en forma H⁺.

Estos grupos, mientras están en forma H⁺, proporcionan un entorno ácido en la columna donde el AA está cargado positivamente e interactúa electrostáticamente con una superficie cargada negativamente.

Esta interacción es fuerte, pero al mismo tiempo es reversible. La fase móvil no contiene tampones ni ningún otro aditivo iónico excepto los que proporciona el agua pura en la mezcla con acetonitrilo (MeCN).

Llamamos a esta técnica Separación de Iones sin Tampón, o BLIS (Buffer Less Ion Separation) para abreviar. Las condiciones simples, detección universal y buena cromatografía hacen que esta técnica sea conveniente para la separación de compuestos polares (ver Fig. 3).

Primesep 200 es una columna de fase inversa (RP) que genera una interacción hidrofóbica y una alta selectividad, que puede controlarse mediante la cantidad de MeCN en la fase móvil (consulte la Fig. 4).

Para compuestos polares, la cantidad de MeCN en la fase móvil produce poco efecto sobre la retención. mientras que con compuestos hidrófobicos, la concentración de MeCN tiene el mismo efecto sobre la retención que en cualquier otra separación de fase inversa (ver Fig. 5).

A una alta concentración orgánica, la interacción iónica se convierte en un componente principal de la retención que aumenta nuevamente debido a la interacción HILIC.

Esta técnica también es aplicable a péptidos y cualquier otro compuesto zwitteriónico.

Una columna con un grupo ácido incrustado más débil, como Primesep C, es más adecuada en el caso de los péptidos: además, si necesario, se pueden usar modificadores de baja fuerza iónica, como el ácido acético o el fórmico, sin afectar significativamente la separación.