Los Cuatro Pasos para una Purificación Perfecta

¿Necesita mejorar sensiblemente la eficacia de sus Métodos de Purificación FLASH con una estrategia clara y simple?

En muchas situaciones, el uso de un método de purificación «Estándar» no permite obtener la separación necesaria para obtener productos con la máxima pureza.

Los equipos de purificación tanto Flash o LCPrep siguen los mismos conceptos cromatográficos que se aplican a la Cromatografía de Líquidos Analítica y un operario experimentado en HPLC analítica no debería tener ningún problema en obtener buenos resultados optimizando las condiciones instrumentales.

Sin embargo, la mayoría de los usuarios de UPFP o LCPrep no son expertos en Técnicas Cromatográficas, y lo que desean es purificar sus productos de síntesis o API’s de la manera más rápida y simple obteniendo, naturalmente, la máxima pureza con las menores pérdidas.

Le proponemos una simple estrategia de 4 pasos que le permitirán obtener mejores resultados sin malgastar columnas o eluyentes.

Los dos ejemplos mostrados a continuación (Figuras 1 y 2) muestran como la elección de un gradiente o un eluyente equivocado generan resultados poco adecuados.

Figura 1. Compuestos insuficientemente resueltos que requieren recolección a volumen fijo con pérdida de producto.

Figura 2. La elección de un eluyente inadecuado no permite optimizar la separación.

1. Transponga adecuadamente su separación TLC a FLASH

Los métodos de Purificación en UPFP normalmente se desarrollan en base a datos obtenidos en separaciones previas mediante Cromatografía de Capa Fina (TLC).

Los datos de retención  obtenidos en TLC se expresan en términos de Factores de Retención (Rf) mientras que en purificación en columna se usa el término Volumen de Columna (CV).

Es posible transferir un método TLC a UPFP gracias a la siguiente relación:

CV=1/Rf

De esta relación se deduce que un valor de Rf menor corresponde a un mayor valor de CV que, a su vez, indica un mayor tiempo de interacción entre el compuesto de interés y el material del lecho de la columna.

Un CV alto indica una retención alta y en dos compuestos adyacentes una mayor resolución, caso siempre preferible.

Es importante constatar que para una buena transposición entre TLC y UPFP es conveniente que los compuestos de
interés eluyan en TLC con valores de Rf comprendidos entre 0.15 y 0.35 para obtener altos valores de CV.

Figura 3. Las condiciones de TLC 1 y 2 son las más adecuadas para obtener condiciones óptimas.

Así se asegura la máxima interacción entre los compuestos y el lecho de sílice (ver Figura 4).

Figura 4. Para ΔCV de 1,1 y 0.8 se obtiene la máxima interacción soluto-fase estacionaria

Un ΔCV alto asegura una mayor separación y, por lo tanto, una menor masa de lecho necesaria. Ver Figuras 5 y 6.

Figura 5. Un ΔCV alto implica en UPFC una mayor separación o una menor necesidad de masa de lecho.

Figura 6. Un ΔCV de 2.8 permite utilizar una columna de 25g en lugar de la necesaria de 80g para un ΔCV de 1.1

Una separación por TLC es siempre isocrática. Se puede transponer tal cual a una purificación FLASH isocrática pero, ¿por qué no obtener ventaja de una purificación FLASH en gradiente?

Una vez obtenidas las condiciones más adecuadas en TLC  se puede utilizar esta transposición genérica a gradiente:

Figura 7. Gradiente genérico para transponer de isocrático a gradiente en UPFC. La fuerza inicial puede disminuirse para mejorar la retención inicial.

La Tabla 1 muestra la equivalencia entre CV (Volúmenes de Columna) y RT (Tiempo de Retención) para columna de 4 hasta 80g de masa de lecho aplicando el Gradiente Genérico de la Figura 7.

Tabla 1. Trabajar en CV resulta práctico si se trabaja con columnas de diferente tamaño ya que el gradiente en CV siempre será el mismo.

 2. Optimizar la Fuerza Eluyente

Existen situaciones en que interesa cambiar el sistema de eluyentes manteniendo la misma fuerza eluyente. Por ejemplo:

  • Si en un determinado par eluyente no se logra una separación y retención entre valores de Rf comprendidos entre 0.15 y 0,35, será necesario investigar el comportamiento con pares de eluyentes diferentes. Es decir, cuando se necesite una selectividad diferente.
    NOTA: El nuevo Software InterSoft X permite la Transposición Automática con una simple foto de su TLC y la aplicación para móvil o tableta (la puede descargar AQUÍ). Sus algoritmos especialmente optimizados permiten extender el rango útil de Rf entre 0.08 y 0.4.
  • Cuando el compuesto de interés absorba fuertemente en la misma λ que uno de los eluyentes.

Veamos la Figura 8 que muestra el Triángulo de Selectividad

Figura 8. Triángulo de Selectividad.

Este gráfico permite al técnico conseguir un cambio en la selectividad del solvente de un modo mucho más rápido que con una selección aleatoria.

La Tabla 2 muestra una serie de eluyentes comúnmente utilizados en purificación FLASH y sus características principales:

Tabla 2. Características principales de los eluyentes más usados en FLASH.

Como ejemplo tomemos las placas siguientes (donde A = Producto A, B = Producto A, C = CRUDO, A+B: Mix A+B):

Figura 9. TLC del mismo producto con eluyentes de diferente fuerza.

En la primera placa el eluyente Heptano:Cloruro de metileno en proporción 80:20  tiene la siguiente fuerza eluyente:

FT = A x FA+B x FB

es decir:

FT = 0.8 x 0.01+0.2 x 0.42 = 0.092

Donde

FT= Fuerza Total
A=% A
FA= Fuerza A (Heptano 0.01)
B=%B
FB= Fuerza B (Cloruro de Metileno 0.42)

Si deseamos modificar la selectividad para mejorar la separación se debe analizar el Triangulo de Selectividad donde se indica que el Cloruro de Metileno (el más polar) pertenece al Grupo 5, por lo que habrá que seleccionar un eluyente lo más alejado posible de ese Grupo, por ejemplo alguno del Grupo 2 o Grupo 8.
Si, por razones de estabilidad, seleccionamos el Cloroformo, perteneciente al Grupo 8. la composición del nuevo eluyente binario (manteniendo el Heptano)  con la misma fuerza eluyente será:

Bnuevo = B x FB/Fnuevo por lo tanto Bnuevo = 0.2 x 0.42/0.40 = 0.21 es decir

8:2 (C7:CHCl3)

Si Seleccionamos, por ejemplo, el 2-Propanol, del Grupo 2 resulta:

Bnuevo = B x FB/Fnuevo por lo tanto Bnuevo = 0.2 x 0.42/0.82 = 0.1 es decir

9:1 (C7:IPA)

En este caso la nueva selectividad invierte A y B pero se obtiene mejor separación.

3. Seleccionar el eluyente en función de la zona de absorción del API

Consideremos el caso mostrado en la Figura 10.

Figura 10. En este caso el API absorbe a 210 nm y el Acetato de Etilo tiene un cut-off de 260nm

El API y sus impurezas absorben a 210 nm (trazo rojo) y el acetato de etilo (trazo azul) lo hace también fuertemente en esa zona impidiendo la detección.

Para permitir la purificación se ha de usar otro eluyente polar que sea transparente y que no absorba en la zona de 200-210nm y se  opta, en una primera fase,  por el uso de Alcohol Isopropílico que es transparente en esta zona del espectro pero de elevada fuerza eluyente.

La acetona es transparente en esa zona y su cutoff es de 225-230nm. Ver Figura 11.

Figura 11. Espectros UV del Acetato de Etilo y de la Acetona

La Figura 12 muestra varias TLC`s con diferentes proporciones de C6:Ac

Figura 12. Selección de la mezcla binaria Hexano:Acetona para obtener un Rf entre 0.15 y 0.35 de los productos de interés.

Figura 13. Gradiente genérico modificado para una mayor retención inicial.

El análisis de las separaciones por TLC indica que se obtiene una buena separación con una mezcla binaria C6:AC 40:60 (fuerza 0.34, superior a la mezcla C6:IPA, pero con diferente selectividad).

Se planifica un gradiente como el de la Figura 13.

Como ΔCV para C6:Ac 40:60 es de 1.54 (separación de dificultad media ver Figura  14) se podría seleccionar una columna de 12g pero, para asegurar la máxima separación se opta por una columna de 25g.

Figura 14. Selección de la masa de la columna en función de DCV..

Con las nuevas condiciones se obtiene:

Figura 15. La elección de un eluyente inadecuado no permite optimizar la separación.

4. Seleccionar la columna de purificación de superiores características

4.1. Tipo de eluyente

La Cromatografía FLASH es una evolución de la cromatografía en columna que todavía es de uso general en los laboratorios de síntesis orgánica.

En general el compuesto de interés, separado por TLC, ha de tener un Rf de 0.15 a 0.35 con el soporte y fase móvil seleccionada. La fase móvil, en general, es binaria con uno de los dos  solventes de mayor polaridad para permitir ajustar fácilmente la polaridad media y optimizar la separación.

En FLASH la fase estacionaria más usada es gel de sílice por lo que al aumentar la polaridad del solvente aumenta la velocidad de elución de todos los componentes de la mezcla. Las fases móviles binarias de polaridad creciente más usuales son cloruro de metileno/hexano, éter/hexano, hexano/etil acetato y cloruro de metileno/metanol. Estas fases móviles, excepto hexano/etil acetato, obligan a trabajar en campana de seguridad.

En general si Rf ~0.2 será necesario usar un volumen de solvente equivalente a 5 veces el volumen del lecho de la columna para completar la separación.

En FLASH instrumental las mezclas pueden ser más complejas: algunos instrumentos permiten el control de hasta cuatro eluyentes diferentes.

El ejemplo muestra de nuevo la separación de una mezcla de dietil y dimetil ftalato en condiciones de gradiente (ciclohexano:etil acetato 100:0 a 85:15 en 7′ + 13′) y gradiente optimizado.

A un caudal de 30 mL/min la contrapresión generada por las columnas de 50, 30 y 15 mm es respectivamente de 0.34, 1.03 y 9.65 bar.

Figura 16. Variación de presión en función del tamaño de partícula.

4.2 Capacidad de carga

La cantidad de fase de la columna necesaria para una buena separación depende la diferencia de Rf entre los compuestos a separar, de su cantidad, de la geometría de la fase y de su empaquetado.

En general por cada gramo de producto se requiere entre 30 y 100g de soporte en una columna tradicional. En las columnas especialmente diseñadas y empacadas para FLASH la capacidad de carga puede expresarse como un porcentaje de la masa de soporte: por ejemplo la serie puriFlash HC de SiO2 esférica de 50 µm de Interchim puede soportar ¡hasta el 20% de la masa de soporte en producto!

Una columna tradicional por gravedad de gel de sílice de 40g, en el mejor de los casos tiene una capacidad de carga de 1.35g.

Una columna PF-50SIHC/40, también de 40g, puede admitir ¡hasta 8g de producto!

Figura 17. Capacidad de carga de SiO2 de clase HC (High Capacity)

4.3. Tamaño y forma de la partícula

Uno de los mayores problemas en la cromatografía FLASH instrumental surge de la calidad de la fase y del empacado de la columna. Una columna mediocremente realizada o empacada con fases de granulometría dispersa genera una menor reproducibilidad que la que se obtiene con partículas perfectamente caracterizadas lote a lote y procedimientos de empacado desarrollados en la producción de columnas analíticas y semipreparativas de alta calidad.

Interchim no solo es uno de los mayores fabricantes de columnas de HPLC sino que además produce soportes con tecnología propia y estrictos controles de calidad, que aplica en la producción de columnas FLASH para garantizar la máxima calidad y prestaciones constantes lote a lote..

El ejemplo muestra la diferencia en prestaciones entre una columna FLASH económica y la columna equivalente PF-50SIHP/40G: no sólo la eficacia es superior a caudal equivalente sino que, además, el consumo de eluyente se reduce en un 30%.

Usando columnas de menor tamaño de partícula la velocidad de la separación aumenta en un factor de 3.

Figura 18. La disminución de las irregularidades (partículas esférica) y del tamaño (hasta 15um) permiten optimizar la purificación FLASH.

NOTA: El nuevo Software InterSoft X permite la Transposición Automática con una simple foto de su TLC y la aplicación para móvil o tableta (la puede descargar AQUÍ).

Sus algoritmos especialmente optimizados permiten extender el rango útil de Rf entre 0.08 y 0.4 y generan automáticamente el Método de Purificación en cualquier equipo puriFlash® de Interchim®.

Cómo contactar con Cromlab

Para cualquier información adicional u oferta de productos contacte con nuestro Departamento Comercial.

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