Los Eluyentes en HPLC

Los solventes en HPLC se utilizan como:

• Fases Móviles
• Para disolver la muestra
• Para preparar las muestras

El uso como Fases Móviles es de principal importancia puesto que sus propiedades han de mantenerse en límites estrechos de aceptabilidad. Además esas propiedades también influyen en la elección del solvente de disolución y el de preparación de la muestra.

En la TABLA 1, se muestran varias propiedades que son importantes al seleccionar el o los solventes en una aplicación de HPLC.

TABLA 1. Propiedades de los solventes más comunes en HPLC

TABLA 2. Absorbancia UV en Función de λ para varios Solventes y Tampones usados en CFI (Cromatografía de Fase Inversa)

Puesto que el agua no absorbe a 200 nm o por encima, la absorbancia de las fases móviles con agua será la misma que la del solvente puro multiplicada por la fracción de volumen (f) del solvente B. Por ejemplo a 220 nm fases móviles con un 25% de los solventes listados de la Tabla 2 tendrán absorbancias de: Acetonitrilo 0.00 AU, Metanol 0.06 AU, THF 0.17 AU, IPA 0.05 AU.

La desgasificación contribuye a una menor absorbancia (aproximadamente un 30% menor) entre 200 y 240 nm en función del menor contenido de oxígeno disuelto, que es mayor cuanto más polar sea el solvente: el efecto de la desgasificación será más notable en solventes más polares como el THF o el IPA.

Se asume que el agua ha sido purificada según ASTM D1139 y que además, si se requieren niveles de detección muy bajos, el valor de TOC (Total Organic Carbon) ha de ser < 50 ppb y la resistividad alta.

En la TABLA 3 se muestran los valores UV de cutoff para varios solventes.

TABLA 3. Propiedades Físicas de varios solventes usados en HPLC

En condiciones de gradiente es necesario que la respuesta del detector se mantenga constante, y es necesario que el solvente A (normalmente agua) y el solvente B respondan de manera similar y si se trabaja a bajas longitudes de onda la elección de solventes disponibles se reduce considerablemente.

1.2. Detección por Índice de Refracción

En condiciones isocráticas la selección de eluyentes no resulta crítica y la sensibilidad puede incrementarse con fases móviles cuyo Índice de Refracción (IR) sea lo más diferente posible que el de los componentes de la mezcla (ver TABLA 3).

Los detectores de IR no pueden utilizarse en condiciones de gradiente por la gran diferencia de respuesta que pueden tener el solvente A y B.

1.3. Detección MS y ELSD

La interfase de un Espectrómetro de Masas o un de Detector por Dispersión de Luz (ELSD) evapora la fase móvil. Las fases móviles como agua, solventes orgánicos y aditivos han de ser volátiles y han de evitarse sales o tapones no volátiles.

Al eliminarse la fase móvil su absorción UV o Índice de Refracción no son factores limitantes pero los solventes han de estar libres de partículas.

2. Polaridad y Selectividad

En la TABLA 4 se muestran los propiedades de los solventes que afecta a la fuerza, selectividad y solubilidad. La «Selectividad Normalizada» incluye tres contribuciones a la interacción soluto.solvente:  La Acidez y la Basicidad de Enlace de Hidrógeno y la Dipolaridad.

TABLA 4. Polaridad y Selectividad de los solventes

Estos tres parámetros son la base del triángulo de la selectividad:

Figura 1. Triángulo de la Selectividad

Otro triangulo muy popular en cromatografía FLASH y Fase Normal es el siguiente (vea como aplicarlo AQUÍ):

Figura 2. Siempre que sea posible, para optimizar la selectividad, se deberían usar mezclas con hexano y Acetato de Etilo (G6), Cloruro de Metileno (G5), Tolueno (G7), THF (G3) y Éter Etílico (G1). Estas combinaciones generan un amplio rango de selectividad y permiten definir la mejor opción para decidir los eluyentes más adecuados para UPFP.

La TABLA 4 muestra el valor de P’, una medida de la polaridad media del solvente. La solubilidad de la muestra tiene relación con los valores de P’ (lo similar disuelve lo similar). Las muestras tienden a ser más solubles en solventes de P’ similar. Los solventes  menos polares como los hidrocarburos disolverán muestras poco polares (valor de P’ bajo). Al contrario solventes con alto P’, disolverán muestra más polares.

La constante dieléctrica ε también tiene relación con la habilidad del solvente de disolver solutos ionizados o tampones: un valor alto de  ε favorece la solubilización de compuestos ionizables.

La TABLA 5 muestra valores de viscosidad de mezclas MeOH/Agua y ACN/Agua en función de la temperatura.

TABLA 5. Viscosidad de mezclas MeOH y ACN con Agua. Se muestran la pérdida de carga en una columna C18 de 100×2.1mm y partícula de 3 μm

Los datos mostrados pueden usarse para estimar la pérdida de carga según la ecuación:

Donde L es la longitud de la columna en mm, η es la viscosidad en cp, F el caudal en mL/min, d_c  es el diámetro interno de la columna y d_p es el diámetro de la partícula en µm.

La TABLA 6 muestra la densidad para algunos solventes comunes, y permite la formulación de fases inversas por pesada de cada componente en la mezcla.

TABLA 6. Densidad de solventes usados en CFI

3. Seguridad

Los solvente usados generalmente en HPLC son muchas veces inflamables y moderadamente tóxicos, y por lo tanto han de almacenarse en una armario metálico de seguridad.

En la TABLA 7 se muestran los valores de Flash Point que indican la inflamabilidad del solvente. La experiencia indica que el metanol (FP 12 ºC) es moderadamente inflamable por lo que productos con FP por encima de ese valor no debería presentar ningún problema en términos de seguridad frente al fuego. Los solventes con FP inferiores son más peligrosos y deberían tratarse con la cautela adecuada.

TABLA 7. Inflamabilidad y Toxicidad

Por cuanto respecta a la toxicidad los solventes deberían manipularse en campana exceptuando el agua. La indicación de su toxicidad viene dada el valor LD₅₀ que es la cantidad en mg/Kg de cuerpo que causa un 50% de mortandad de la población. Sin embargo los solventes usados en el laboratorio muy raramente se ingestan y su peligro más inmediato es por contacto o inhalación. La Acetona con un LD50 no es claramente un problema aunque su FP de -18ºC requiere atención por cuanto respecta al riesgo de fuego.