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  • Columnas Thermo Scientific para Bio Cromatografía

    Columnas para Cromatografía de Proteínas y para Proteómica

¿Qué es la Purificación de Péptidos y Proteínas?

La purificación de proteínas se realiza a escala laboratorio (microgramos y miligramos) o nivel industrial (kilogramos a toneladas).
Los métodos más comunes para la purificación preparativa de proteínas son cromatográficos que separan según las diferencias entre las propiedades de la proteína a purificar (la proteína objetivo) y las propiedades de otras sustancias en la muestra.
En algunos laboratorios las proteínas se purifican en paralelo, utilizando sistemas de cromatografía automatizados.
Los métodos cromatográficos más usados son, por ejemplo, la Filtración de Gel (GFSEC o GPC), el Intercambio Iónico (IEX o IC), la Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC) y la Cromatografía de Fase Inversa (RPC).

Todos los equipos de la serie P de Interchim® como 5.250P han sido diseñados y optimizados para operar con todas esas técnicas y con todas las bio-columnas de separación más usuales.

Guía de Selección Rápida de Columnas para BioLC

Métodos y Columnas para Purificación de Proteínas

Cromatografía de Afinidad (AC)

Alta Resolución – Alta Capacidad


En Cromatografía de Afinidad (AC) las proteínas se separan en base a una interacción reversible entre la proteína y un ligando específico unido a la fase cromatográfica.

La proteína a purificar se une específicamente y reversiblemente mediante un ligando específico. El material no ligado se eluye y la proteína ligada se recupera cambiando las condiciones: un ligando competitivo, el pH, la fuerza iónica o la polaridad.

Una variante interesante es la Cromatografía de Afinidad con Metal Inmovilizado (IMAC) en la que la interacción es entre proteínas con grupos funcionales histidina o marcadas con histidina e iones metálicos divalentes (Ni2+, Cu2+, Zn2+, Co2+) inmovilizados mediante un ligando quelante.

En este caso la columna IMAC se equilibra con un tampón con baja concentración de imidazol que se une al metal inmovilizado y se transforma en el contra-ligando.

La muestra se ajusta a la misma concentración de imidazol que el tampón ligante antes de su carga en la columna y ésta se lava con el tampón ligante. La elución se efectúa mediante un gradiente de imidazol hasta 100 o 500 mM o por etapas.

En la elución por gradiente se observan a menudo dos picos, uno previo a la proteína marcada con histidina que corresponde a proteínas del lisado que se unen de manera natural.

En la elución por etapas se observa un pico único de la proteína marcada con una pureza ligeramente menor que se puede re-purificar con otro método adecuado.

Volumen de muestra y capacidad
Depende del medio usado y no depende del volumen de muestra.

Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y contaminarse que puedan ligarse a la columna.

Tampones
Los tampones de ligando, elución y regeneración son específicos para cada fase.

Cómo optimizar el método

  • Seleccione el medio específico para la proteína
  • Seleccione el caudal óptimo para una unión «binding» eficaz
  • Seleccione el caudal óptimo para obtener la máxima recuperación
  • Seleccione el caudal óptimo de regeneración para minimizar la duración del método

En AC, la proteína objetivo está unida de forma específica y reversible por una sustancia complementaria  de unión (ligando). La muestra se aplica en condiciones que favorecen la unión específica al ligando. El material no unido se elimina de la columna y se recupera la proteína objetivo cambiando a condiciones de elución. La elución se realiza específicamente, utilizando un ligando competitivo, o inespecíficamente, cambiando, por ejemplo, pH, fuerza iónica o polaridad. La proteína objetivo se eluye en forma purificada y concentrada.

Columnas de Afinidad

MAbPac Protein A es una columna de fase polimérica única no porosa diseñada para una rápida y precisa determinación de la titulación anticuerpos monoclonales en cultivos de células.

ProPac IMAC-10 es una columna analítica y semi-preparativa para la separación de proteínas y péptidos mediante cromatografía de afinidad por metal inmovilizado. Se suministra en partículas no porosas de 10 μm recubiertas con una capa hidrofílica injertada con cadenas poli(IDA).

La columna monolítica de afinidad ProSwift ConA-1S es insuperable para un rápido, altamente eficiente enriquecimiento y purificación de Concanavalina A (Con A) que se une a glucanos, glicopéptidos y glicoproteínas que contienen regiones ricas en manosa.

Cromatografía de Filtración de Gel (GF, SEC, GPC)

Alta Resolución


La 
Cromatografía por Filtración de Gel (GF, SEC o GPC) separa proteínas en función de las diferencias de tamaño molecular.

Puesto que la composición del tampón no afecta directamente la resolución, sus condiciones pueden adaptarse en función de la muestra o las necesidades de purificación siguientes.

Volumen de muestra y capacidad
Para una resolución máxima el volumen de muestra no debe superar el 5% del volumen total de la columna.

Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y se debe reducir su viscosidad por dilución si fuera necesario.

Tampones
Seleccione un tampón compatible con la estabilidad de su proteína con una fuerza iónica equivalente a 150 mM NaCl, como mínimo

Cómo optimizar el método

  • Seleccione el medio  con su proteína en el centro de su rango de separación.
  • Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación. Un flujo bajo mejora la resolución de componentes de alto PM y viceversa.
  • Determine el volumen máximo de muestra sin pérdida de resolución (normalmente el 0.5-5% del volumen de columna).
  • Aumente la resolución disponiendo columnas en serie.

GF es fácil de usar y permite la separación de sustancias con diferencias en tamaño molecular bajo condiciones blandas.
GF también se llama cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), que describe más acertadamente el mecanismo de separación, o Cromatografía de Permeación de Gel (GPC).
Todos se usan en la purificación de proteínas.

Columnas de Exclusión por Tamaño

Las Columnas Thermo Scientific™ BioBasic SEC, a base de sílice con un recubrimiento polimérico patentado, ofrecen la estabilidad mecánica de las columnas de exclusión por tamaño a base de sílice con mayores eficiencias que las columnas a base de polímeros.

BioBasic SEC está disponible en cuatro tamaños de poro (60Å, 120Å, 300Å, 1000Å), haciéndola ideal para la determinación del peso molecular de péptidos, proteínas y polímeros solubles en agua.
También se pueden utilizar para limpiar la muestra antes de otros análisis.

Thermo Scientific™ MAbPac SEC-1 (sílice de 300 Å y 5 μm) es una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) diseñada específicamente para la separación y caracterización de anticuerpos monoclonales (MAb) y sus agregados, así como el análisis de Fragmentos Fab y Fc resultantes de la proteólisis.

Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)

Buena Resolución – Buena Capacidad


La Cromatografía por Interacción Hidrofóbica (HIC) separa proteínas en función de las diferencias de hidrofobicidad, y se basa en la interacción reversible de una proteína con la superficie hidrofóbica de la columna. La interacción se refuerza con tampones de elevada fuerza iónica y hacen de HIC el método ideal para separar proteínas obtenidas por precipitación con sulfato amónico o previamente separadas por IEX.

Volumen de muestra y capacidad
Para una resolución máxima el volumen de muestra no debe superar el 20% de la capacidad de enlace de la columna. HIC es una técnica de enlace y no depende del volumen de la muestra.

Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y con el mismo pH del tampón inicial y con alta fuerza iónica.

Tampones
Si desconoce la hidrofobicidad de su proteína pruebe estas condiciones

  • Tampón Inicial (A): 50 mM Na2HPO4 x 2H2O pH 7.0 + 1.0 M Sulfato Amónico
  • Tampón Eluyente (B): 50 mM Na2HPO4 x 2H2O pH 7.0
  • Gradiente: 0-100% B en 10-20 CV

Cómo optimizar el método

  • Seleccione un gradiente para una separación aceptable.
  • Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación.
  • Para purificaciones en gran escala pruebe un gradiente por etapas.
  • Las especies que adsorban fuertemente en un medio se eluyen más fácilmente cambiando a una fase menos hidrofóbica.

Muchos componentes de la muestra se unen a una columna HIC en una solución de alta fuerza iónica, típicamente Sulfato Amónico 1 a 2 M o NaCl 3 M. Las condiciones se alteran para que las sustancias ligadas eluyan diferencialmente.
La elución se realiza generalmente disminuyendo la concentración de sal (disminución de fuerza iónica), con un gradiente de sal decreciente continuo o también en etapas.
Generalmente, las muestras se eluyen con un gradiente decreciente de Sulfato Amónico.
Las proteínas objetivo se concentran en la fase inicial de la adsorción (inyección)  y se recogen en forma purificada y concentrada.

Columnas de Interacción Hidrofóbica

Thermo Scientific™ ProPac HIC-10 es una fase de alta resolución y capacidad basada en sílice de 300Å y partículas de 5μm que permite separaciones de alta resolución de proteínas y variantes en aplicaciones analíticas y preparativas.

Las columnas ProPac HIC tienen también una estabilidad hidrolítica excepcional bajo las condiciones altamente acuosas usadas en HIC.

Cromatografía de Fase Inversa (RPC)

Alta Resolución


La Cromatografía de Fase Inversa (RPC)) separa proteínas en función de las diferencias de hidrofobicidad, y se basa en la interacción reversible entre una proteína cargada y un soporte cromatográfico hidrofóbico. Las proteínas se ligan al soporte en el momento de la inyección y, puesto que el enlace proteína – fase estacionaria suele ser muy fuerte, se eluyen diferencialmente mediante un gradiente en el que se aumenta la concentración de solvente orgánico, normalmente acetonitrilo.

RPC se usa muchas veces como método de purificación final de oligonucleótidos y péptidos, y resulta ideal en aplicaciones analíticas como la generación de mapas de péptidos.

Sin embargo RPC no es recomendable si se quiere mantener la actividad o la estructura terciaria de la proteína puesto que muchas se desnaturalizan en presencia de solventes orgánicos.

Volumen de muestra y capacidad
La capacidad total depende mucho de las condiciones experimentales y de las propiedades de la fase y de la muestra. Para una separación óptima en elución por gradiente seleccione una carga que no afecte a la resolución de la columna. Como RPC es una técnica de enlace no depende del volumen de la muestra.

Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y disueltas en el eluyente inicial. Si son insolubles puede probar (pruebe antes con una fracción de la muestra, un péptido muy hidrofóbico puede precipitar o ligarse irreversiblemente a la fase):

  • Ácido Acético 10-30%
  • Ácido Fórmico 70%
  • Guanidina HCl 6M
  • DMSO 100%. 
  • TFA

Tampones
Si desconoce las características de su proteína pruebe estas condiciones:

  • Eluyente Inicial (A): 0.1% TFA en 5% ACN
  • Eluyente (B): 0.1% TFA en 80% ACN
  • Gradiente: 0-100% B en 20 CV

Cómo optimizar el método

  • Seleccione la fase óptima mediante pruebas con diferentes columnas.
  • Seleccione el gradiente más pronunciado para obtener una resolución aceptable. Use 0-100% B en muestras desconocidas.
  • Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación.
  • Para purificaciones en gran escala pruebe un gradiente por etapas
  • Las muestras que adsorban fuertemente en una fase se eluyen más fácilmente en una fase menos hidrofóbica.

Las proteínas se ligan al soporte en el momento de la inyección y, puesto que el enlace proteína – fase estacionaria suele ser muy fuerte, se eluyen diferencialmente mediante un gradiente en el que se aumenta la concentración de solvente orgánico, normalmente acetonitrilo.
La fuerza de enlace puede modularse con aditivos (par iónico) o con solventes como Metanol, Etanol y propanol.
¡Use RPC si sus proteínas son estables en los solventes orgánicos usados!

Columnas de Fase Inversa

Las columnas Thermo Scientific™ BioBasic de fase inversa permiten una cromatografía superior gracias la química de enlace extra densa de ña fase que produce una superficie altamente estable y reproducible para resultados extremadamente fiables.
Las fases inversas BioBasic se suministran en químicas C18, C8 y C4.

Las columnas Thermo Scientific™ Acclaim 300 C18 de fase inversa se suministran con partículas de sílice de 3 μm para el análisis rápido de digeridos de proteínas complejas.
En comparación con las fases estacionarias de 5 μm,las más pequeñas partículas permiten mayores caudales y gradientes menos profundos con columnas más cortas, y permiten un análisis de separación más rápido.

Las columnas Monolíticas Thermo Scientific™ ProSwift RP de fase inversa ofrecen, de manera única, las ventajas de la alta resolución a caudales excepcionalmente altos para el análisis y separaciones rápidas de Proteínas.

Cromatografía de Intercambio Iónico (IC, IEX)

Alta Resolución – Alta Capacidad


La Cromatografía por Intercambio Iónico (IC o IEX)) separa proteínas en función de las diferencias de su carga superficial neta, y se basa en la interacción reversible entre una proteína cargada y un soporte cromatográfico con carga opuesta. Las proteínas se ligan al soporte en el momento de la inyección y se eluyen diferencialmente mediante un gradiente en el que se modifica la concentración de sales o el pH. 

Volumen de muestra y capacidad
Para una separación óptima en elución por gradiente no supere el 20% de la capacidad total de la columna. Como IEX es una técnica de enlace no depende del volumen de la muestra.

Preparación de la muestra
Las muestras han de estar libres de partículas y con el mismo pH y fuerza iónica del tampón inicial.

Tampones
Si desconoce las características de carga de su proteína pruebe estas condiciones

Intercabio Aniónico

  • Tampón Inicial (A): 20 mM Tris-HCl, pH 7.4
  • Tampón Eluyente (B): 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 + 1 M NaCl pH 7.4
  • Gradiente: 0-100% B en 10-20 CV

Intercambio Catiónico

  • Tampón Inicial (A): 20 mM Na2HPO4 x 2H2O, pH 6.8
  • Tampón Eluyente (B): 20 mM Na2HPO4 x 2H2O + 1 M NaCl pH 6.8
  • Gradiente: 0-100% B en 10-20 CV

Cómo optimizar el método

  • Seleccione el intercambiador iónico óptimo.
  • Seleccione el pH óptimo.
  • Seleccione el gradiente más pronunciado para obtener una resolución aceptable al pH seleccionado.
  • Seleccione el caudal máximo que mantenga la resolución y minimice el tiempo de separación.
  • Para purificaciones en gran escala pruebe un gradiente por etapas para reducir los tiempos de
  • separación y el consumo de tampones

Muchos componentes de la muestra se unen a una columna IEX en una solución de alta fuerza iónica, típicamente Sulfato Amónico 1 a 2 M o NaCl 3 M. Las condiciones se alteran para que las sustancias ligadas eluyan diferencialmente. La elución se realiza generalmente disminuyendo la concentración de sal (disminución de fuerza iónica). Los cambios se realizan con un gradiente de sal decreciente continuo o también en etapas. Generalmente, las muestras se eluyen con un gradiente decreciente de Sulfato Amónico. Las proteínas objetivo se concentran en la fase inicial de la adsorción (inyección)  y se recogen en forma purificada y concentrada.

Columnas de Intercambio Iónico

Las columnas Thermo Scientific™ ProPac™ y Thermo Scientific™ MAbPac™ usan fases estacionarias de partículas de núcleo pelicular no poroso que proporcionan una resolución y eficacia excepcionalmente altas en separaciones de variantes de proteínas, resolviendo isoformas que difieren en un único residuo cargado.

Una capa hidrófilica evita interacciones secundarias no deseadas, y una superficie de intercambio catiónico injertada proporciona control de la selectividad en base al pH y una transferencia de masa rápida para una separación de alta eficiencia y capacidad moderada.

Las Columnas ProPac™ WCX y MAbPac™ SCX han sido específicamente desarrolladas para separación monoclonal y caracterización analítica.

Las aplicaciones incluyen variantes de proteínas en una variedad de matrices, como productos biofarmacéuticos y lácteos.

Las columnas MAbPac™ han sido diseñadas específicamente para el análisis de variantes de anticuerpos monoclonales.

Las columnas Thermo Scientific™ BioBasic AX y BioBasic SCX de Intercambio iónico demuestran una reproducibilidad superior tanto columna a columna como lote a lote gracias a que la sílice de 5 μm y 300 Å proporciona una alta eficiencia.
Ambas fases proporcionan prestaciones superiores para proteínas, péptidos y ácidos nucleicos en condiciones de intercambio iónico compatibles con proteínas.

Los monolitos de intercambio iónico ProSwift proporcionan una excelente alternativa a los medios de intercambio iónico porosos o no porosos. Ofrecen mayor capacidad de carga frente a las fases peliculares y una resolución excelente en comparación con los medios de intercambio iónico porosos tradicionales.

Columnas para Oligonucleótidos


Las columnas de intercambio aniónico fuerte Thermo Scientific DNAPac ofrecen una resolución líder en la industria en el análisis y purificación de oligonucleótidos sintéticos.

Las columnas DNAPac pueden resolver oligonucleótidos de longitud completa a partir de secuencias de fallo n–1, n+1 y otras no posibles con otras columnas.

Thermo Scientific™ DNASwift™ una columna monolítica de intercambio aniónico fuerte que proporciona una pureza de oligonucleótidos excepcionalmente alta.

Esta columna semi preparativa incorpora la alta resolución y selectividad de la columna DNAPac pero con mayor capacidad de carga.

Columnas para Glicanos


Las columnas para carbohidratos Thermo Scientific™ GlycanPac™ AXH-1 y GlycanPac™ AXH-1 AXR-1 son columnas para HPLC diseñadas para la separación simultánea de glicanos por carga, tamaño y polaridad, tanto marcados para fluorescencia o nativos.

Otra columna interesante para la separación de glicanos es Thermo Scientific™ Accucore 150-amide-HILIC. Esta fase ofrece una fuerte interacción de enlace de hidrógeno entre la fase estacionaria y los analitos, resultando en una selectividad única si se compara con otras fases HILIC.

La combinación con el amplio poro de las partículas de núcleo sólido hace que Accucore 150-amide-HILIC resulte muy adecuada para separar una gran variedad de moléculas hidrofílicas, inclusive carbohidratos, péptidos y glicanos

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