Eliminando Cuellos de Botella en Síntesis Orgánica con Procesos de Purificación Optimizados

Original whitepaper:
Breaking Through Bottlenecks in Organic Synthesis with a Streamlined Purification Workflow.
Copyright 2020 by Advion X Interchim

La síntesis orgánica es tanto una ciencia precisa como un arte, como lo afirma el químico de productos naturales K.C. Nicolaou de la Universidad de Rice ⁽¹⁾. La síntesis orgánica implica replicar moléculas complicadas de sistemas naturales y crear en un laboratorio productos similares que puedan ser usados como productos farmacéuticos, combustibles, agrícolas y muchos otros materiales de uso diario.

Los químicos orgánicos de síntesis, como profesionales que poseen las habilidades para desarrollar estas moléculas, funcionan no sólo como científicos y artistas, sino también como chefs en la forma en que abordan su trabajo. Cuando los chefs crean un plato, realizan comprobaciones periódicas (mirando, probando y oliendo) para asegurarse de que el resultado es el deseado. De la misma manera, los químicos orgánicos de síntesis necesitan identificar compuestos en cada paso de su síntesis y purificar los productos deseados antes de pasar al siguiente paso. «Necesitas confirmar que estás obteniendo lo que quieres, y lo has de tener en estado puro o limpio lo mejor que puedas antes de continuar con la síntesis», dice Daniel Eikel, director de aplicaciones de producto y servicio al cliente en Advion X Interchim, dos empresas que recientemente se han unido para ofrecer un conjunto completamente integrado de espectrometría de masas (MS) y soluciones cromatográficas para investigadores de ciencias de la vida.

Aunque la monitorización de la reacción, la identificación de compuestos y la purificación son algunas de las piedras angulares de una síntesis exitosa, también son largas, consumen muchas horas de trabajo y crean muchos cuellos de botella. Eikel dice que un flujo de trabajo que pueda vincular estos pasos para crear un proceso continuo con la ayuda de un software autónomo puede ayudar a acelerar el proceso de síntesis. «Eso es lo que hemos intentado crear al combinar la Cromatografía de Capa Fina (TLC), MS y cromatografía Flash» dijo. (Figura 1)

Figura 1. Flujo de trabajo que acopla TLC con MS y Cromatografía Flash para aumentar la velocidad y eficacia de una síntesis. APCI indica Atmospheric Pressure Chemical Ionization.

Uno de los métodos más comunes que se utilizan para comprobar el progreso de una reacción es la toma de alícuotas de la solución en diferentes momentos y cargándolas en una placa de TLC. La parte inferior de la placa TLC se sumerge en una mezcla de disolventes que separara los componentes a medida que el disolvente migra hacia la parte superior de la placa. Cuando la placa se revela, se pueden identificar manchas que corresponden al material de partida, a los productos deseados y a los subproductos.

«Efectúo muchas TLC analíticas y preparativas en el laboratorio», dice Anushka Chathuranga, postdoctoral asociada  en Scripps Research en La Jolla, California, que estudia agentes anticancerígenos de molécula pequeña. «Una cosa que hace que la identificación del compuesto sea realmente difícil es cuando tengo dos compuestos con factores de retención que se acercan en valor. Puede ser problemático y laborioso purificar los compuestos sin la precisión y confianza de saber quien es quien».

Como investigador científico senior en OmegaChem en Lévis, Québec, Augustin Péneau utiliza muchas técnicas analíticas para identificar y purificar las moléculas orgánicas que sintetiza. Indica que el tiempo es un hándicap importante en la mayoría de análisis. “En la industria farmacéutica, tenemos altos estándares en la confirmación estructural debido a problemas de patentes, y es por eso que también tenemos que verificar, por duplicado triplicado, antes de la validación de la estructura; esto lleva tiempo ”, dice Péneau. «También está la pregunta de ¿cuán precisos son mis datos, vinculada a cuán precisos o confiables son mis métodos analíticos? «

La preocupación sobre la precisión son comunes en métodos como TLC. Los químicos de síntesis a menudo deben recurrir a conjeturas para determinar qué representa cada mancha en una TLC. Para identificar un compuesto que no es activo en el ultravioleta (UV) y no detectable con la lámpara ultravioleta, un químico necesitaría raspar la mancha en la placa de TLC, extraer el compuesto, purificarlo, concentrarlo e inyectarlo en un espectrómetro de masas. Este proceso requiere tiempo y un esfuerzo manual sustancial, y el resultado puede no ser muy preciso o limpio. Pero Las tecnologías automatizadas por TLC/MS directo, desarrolladas hace unos años, han simplificado el proceso.⁽²⁾

El flujo de trabajo Advion X Interchim inicia con una configuración directa de TLC/MS, en la que se pueden identificar manchas de una placa de TLC sin raspar, preparar la muestra, limpiar o un largo análisis por LC-MS, según Eikel.

“El espectrómetro de masas compacto genera un espectro de masas directamente de esa placa TLC en unos 30 segundos e indica sin ambigüedades cuál es la masa del analito”, dice Eikel. «La técnica de muestreo superficial del lector Advion Plate Express efectúa una extracción de líquido directamente de la placa TLC que se introduce en e espectrómetro de masas», añade.

Permitir que un lector de placas automático identifique compuestos mientras se ejecuta una reacción (o después) puede aligerar considerablemente la carga de un químico. El científico solo tiene que colocar la placa TLC debajo del lector de modo que la mancha a identificar esté alineado con una guía láser. Las tecnologías MS disponibles en la actualidad son lo suficientemente sensibles como para ionizar directamente cantidades mínimas del compuesto y proporcionar un espectro preciso (Figura 2).

Figura 2. Se coloca una placa de TLC debajo del cabezal del lector de placas (derecha). Con la mancha de interés alineada correctamente, una pulsación rápida del botón hace descender el cabezal del lector de placas y le permite extraer muestra con un solvente para ser enviada directamente al espectrómetro de masas (izquierda).

La dificultad de separar compuestos con factores de retención cercanos en valor puede ser resuelta; Eikel dice que «incluso si las manchas están muy juntas (por ejemplo, a unos pocos milímetros de distancia), el lector de placas puede distinguirlas y proporcionar dos picos separados en el espectro de masas. Esa distinción es posible porque la extracción se puede hacer con precisión en una zona más baja en una mancha y en una zona más alta en la otra para minimizar la superposición», dice. «Este proceso es automático y la superficie de extracción es de aproximadamente 2 x 1 mm², que es mucho más preciso que si se hiciese a mano”, explica Eikel. «Al extraer de una superficie tan pequeña, prácticamente no hay superposición, algo que no es posible cuando la extracción se realiza manualmente», agrega.

Gang Chen, director de laboratorio de la Universidad Simon Fraser, confirma que  TLC Plate Reader es una herramienta útil para control de reacciones. «No es un juego de adivinanzas», dice,  al comparar el muestreo directo por TLC con la manera tradicional de tratar de igualar los datos de cromatografía líquida de fase inversa alto rendimiento (HPLC) con los resultados de TLC en fase normal. A Chen, esa falta de especulación es una ventaja notable en la identificación de productos.

Según el estudiante de posgrado de la Universidad de Harvard Matthew Volpe, el lector de placas TLC se ha convertido en un dispositivo esencial para sus estudios de  sobre el metabolismo bacteriano en el microbioma humano. «A menudo trabajamos con objetivos sintéticos que no tienen actividad UV y son difíciles de teñir fiablemente”, dice Volpe. «Poder comprobar la masa de un producto en una placa de TLC es genial». También ayuda a detectar contaminantes, que solo son detectables por MS. A continuación, puede pasar rápidamente a el siguiente paso: purificación.

La cromatografía Flash es una técnica de separación que utiliza gas comprimido (como nitrógeno o aire) o una bomba para empujar los solventes a través de una columna de presión baja a media. Introducida a finales de 1970, se la conoce como uno de los métodos mas simples de cromatografía preparativa para la purificación de rutina de compuestos orgánicos.⁽³⁾⁽⁴⁾ Sin embargo, la eficiencia sigue siendo un desafío para los laboratorios que regularmente efectúan purificaciones flash.

Chathuranga en Scripps dice que la HPLC puede ser muy útil pero que determinar qué tipo de técnica de separación hay que usar «requiere muchas purificaciones de prueba y error para optimizar las condiciones «. En su opinión, la opción más sencilla es la cromatografía flash, que utiliza con frecuencia, aunque implica más interferencia humana y normalmente su uso no es muy fácil.

Hansamali Sirinimal, un químico orgánico que trabaja en un laboratorio industrial en Michigan, se hace eco de Chathuranga sobre la purificación Flash. «Puede tomar una gran cantidad de tiempo y una gran cantidad de disolventes”, dice.

Una solución a estos problemas con la cromatografía Flash podría venir en la forma de un sistema que acople de manera eficiente los resultados de la placa TLC a un método de purificación generado y optimizado automáticamente. Eikel dice que el flujo de trabajo Advion X Interchim se desarrolló con esta idea in mente, al incorporar un sistema cromatográfico Flash (desarrollado por Interchim) que se puede programar directamente con la información obtenida en la separación de la placa TLC: solo se necesita una imagen obtenida en un teléfono inteligente y un poco de matemáticas.

Básicamente, todo lo que un investigador debe hacer para purificar un compuesto es tomar una foto de la placa TLC y enviarlo al sistema de purificación flash a través de una aplicación para teléfono inteligente creada específicamente para vincular datos de TLC a un método de separación en columna. El software instalado en el sistema flash genera automáticamente un método en gradiente de purificación en columna mediante el análisis de los datos TLC proporcionados por el usuario (figura 3).

«El software tiene en cuenta muchas cosas, como la cantidad de material que desea purificar, el tamaño de la columna, el tipo de material del lecho de la columna y su tamaño de partícula”, dice Eikel. “Todos esos datos se consideran por el algoritmo al sugerir un método que proporciona una separación óptima».

«La capacidad de utilizar los factores de retención en TLC a un método de cromatografía Flash es lo que hace que la purificación sea tan eficiente», según Daniel Flaherty de la Universidad de Purdue. Eikel dice que «usar la información de separación de una placa TLC en un cromatógrafo Flash es más fácil que en cualquier sistema de HPLC, porque la química de separación es la misma para una placa TLC de sílice y una columna Flash de sílice».

Otro desafío común surge para los químicos sintéticos en el paso final del proceso de identificación y purificación del compuesto, en el sentido de que deben confirmar que la fracción recolectada contiene el compuesto correcto. Esta confirmación normalmente requiere una lenta cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Para hacer frente a este cuello de botella, Advion desarrolló una herramienta capilar de vidrio que puede ser sumergida en la fracción colectada y posteriormente insertada en la fuente de iones APCI de un espectrómetro de masas compacto CMS expression^® para identificar un compuesto en segundos.

Este accesorio de sonda de inmersión o sonda de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP), se inventó en 2005 por Charles N. McEwen de la Universidad de Ciencias. Este accesorio permite a los químicos confirmar sus fracciones en tiempo real.⁽⁵⁾⁽⁶) En la fuente de un espectrómetro de masas, un flujo de nitrógeno caliente vaporiza la muestra del capilar de vidrio de la sonda. Un pin de descarga corona ioniza instantáneamente la muestra para generar un espectro de masas en menos de 30 segundos (figura 4).

Figura 4. La punta capilar de ASAP se sumerge en uno de los tubos con la fracción identificada (izquierda) y se inserta en el espectrómetro de masas, donde se analiza al instante por la fuente de iones APCI (esquema de la derecha).

«Me encanta poder sumergir la sonda ASAP en una muestra en la campana y luego girar, insertar la sonda en el espectrómetro de masas compacto, y ver el espectro de masas inmediatamente”, dice Louis Mueller, un estudiante de posgrado en la Universidad de Drexel, Pensilvania. “El sistema  ha aumentado mi productividad, y me ha ampliado la visión más allá de lo que puede una cromatografía TLC normal».

Eric Price de la Universidad de Saskatchewan en Canadá está desarrollando nuevos fármacos con radionúclidos e imagen molecular. Dice que prefiere usar el sistema ASAP/MS porque «no hay necesidad de preocuparse por la compatibilidad del solvente, solubilidad o concentración». «Este método de análisis es muy rápido para muestras adecuadas para la fuente APCI», agrega.

Según Eikel, la expectativa hace unas décadas era que un químico orgánico pudiera completar un paso de síntesis al día. Esto ahora ha subido a aproximadamente dos pasos por día, pero la purificación se ha vuelto más rigurosa. La mayoría de los químicos purifican sus soluciones después de cada paso para obtener un mejor rendimiento. «Yo no creo que sea fácil ni posible purificar dos pasos en un día, actualmente, sin un flujo de trabajo rápido y optimizado”, dice Eikel. «Hemos descubierto que al usar TLC/MS para el seguimiento de una reacción, se pueden ahorrar horas de tiempo de reacción. Con un sistema de purificación Flash eficiente acoplado a una sonda para masas, se pueden producir más pasos de síntesis al día».

Cuando se desarrolló este tipo de flujo de trabajo optimizado, uno de los objetivos de Advion X Interchim era hacerlo de fácil uso. Por ejemplo, los instrumentos debían ser compactos y aptos para caber en una campana extractora; las funciones del software debían ser simples; y quizás lo más importante, debía construirse con el propósito específico de acoplar y acelerar la identificación y purificación de compuestos. Eikel cree que la mayor ventaja de este sistema TLC/MS es cómo combina múltiples componentes que funcionan bien juntos para mejorar la eficiencia de los flujos de trabajo en síntesis orgánica.

Daniel Flaherty de la Universidad de Purdue dice que la configuración que su equipo ha estado usando durante un tiempo, ha incrementado la eficiencia de síntesis porque los componentes son complementarios y de fácil uso. “La forma en que el flujo de trabajo integra MS y predice las condiciones de la cromatografía flash para una purificación eficiente, basada en TLC, hace que valga la pena invertir en el sistema», dice.

1. K. C. Nicolaou, “Organic Synthesis: the Art and Science of Replicating the Molecules of Living Nature and Creating Others Like Them in the Laboratory,” Proc. R. Soc. A 470, no. 2163 (March 8, 2014), https://doi.org/10.1098/rspa.2013.0690.
2. Si Chyi Cheng, Min-Zong Huang, and Jentaie Shiea, “Thin Layer Chromatography/Mass Spectrometry,” J. Chromatogr. A 1218, no. 19 (May 2011): 2700–11, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2011.01.077.
3. W. Clark Still, Michael Kahn, and Abhijit Mitra, “Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution,” J. Org. Chem. 43, no. 14 (July 1, 1978): 2923–25, https://doi.org/10.1021/jo00408a041.
4. Alan J. Shusterman, Patrick G. McDougal, and Arthur Glasfeld, “Dry-ColumnFlash Chromatography,” J. Chem. Educ. 74, no. 10 (Oct. 1, 1997): 1222, https://doi.org/10.1021/ed074p1222.
5. Charles N. McEwen, “Atmospheric Pressure Solid Analysis Probe (ASAP), ”Encyclopedia of Analytical Chemistry, ed. Robert A. Meyers (Wiley, 2010) https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/9780470027318.a9045.
6. Charles N. McEwen, Richard G. McKay, and Barbara S. Larsen, “Analysis of Solids, Liquids, and Biological Tissues Using Solids Probe Introduction at Atmospheric Pressure on Commercial LC/MS Instruments,” Anal. Chem. 77, no. 23 (Oct. 14,
   2005): 7826–31, https://doi.org/10.1021/ac051470k.

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