Selección del Método de Purificación y de las Columnas FLASH en UPFP

En este caso, el objetivo de la purificación es, básicamente, la eliminación de un reactivo en exceso, que absorbe fuertemente en el visible,  sobre el API de interés que absorbe entre 210 y 220 nm. Los resultados obtenidos con estrategias convencionales no son lo suficientemente buenos y se requiere una segunda purificación.

Para evitar la fuerte absorción del Acetato de Etilo (eluyente polar más utilizado en purificación FLASH) entre 210 y 220nm  el usuario opta por usar de Alcohol Isopropílico (IPA) que es transparente en esta zona del espectro.  Aunque la Fuerza del Eluyente no parece excesiva (pasa de 0.01 a 0.09 en 28CV), el caudal aplicado para una columna de 4g (CV Col=5mL) es exagerado (18 mL/min), tal como muestra la escasa resolución obtenida (a 210nm se adivinan 3 componentes no resueltos).

Resultados con columna Redisep de 4g y equipo ISCO CombiFlash.

Para mejorar la purificación se plantea la siguiente estrategia previa:

Eluyente

El IPA no parece ser la mejor solución en este caso y se cambia totalmente por Acetona o Acetato de Etilo que ofrecen una selectividad diferente.

Dado que el Acetato de Etilo absorbe fuertemente en la zona de absorción del API (210nm) se opta por Acetona que ofrece una ventana en la zona entre 210 y 230nm.

Espectro UV del Acetato de Etilo, transparente a partir de 250nm, y Acetona que absorbe a partir de 240nm.

Gradiente

El análisis de las separaciones por TLC indica que se obtiene una buena separación con una mezcla binaria C6:AC 40:60 (fuerza 0.34, superior a la mezcla C6:IPA, pero con diferente selectividad) con los compuestos bien separados en la zona comprendida entre Rf 0.15 y Rf 0.35 (ver más información).

C6:AC Separación por TLC en diferentes condiciones de fuerza eluyente. Los compuestos de interés han de estar entre Rf 0.15 y Rf 0.35.

En los procesos de optimización manual los compuestos de interés han de estar entre Rf 0.15 y Rf 0.35. Sin embargo, los algoritmos empleados para el desarrollo del método de purificación en InterSoft X «Genius» permiten ampliar el rango desde Rf 0.08 hasta Rf 0.40.

Con el método de optimización manual se planifica un gradiente estándar siguiente:

Gradiente Estándar general para una primera aproximación.

Columna

Una columna de 4g empleada no es la más adecuada para una separación difícil (ΔCV<1.5), y menos en las condiciones adoptadas. La Tabla indica que la columna más adecuada ha de ser de al menos 25g para aceptar entre 150 y 200mg de crudo.

La columna adecuada para una separación difícil (ΔCV<1.5) de 150 a 200mg de crudo ha de ser de 25g.

Se selecciona una columna PF-30HP/25g de 30μm de tamaño de partícula para garantizar una mayor eficacia.

Carga e Inyección de Muestra

Como el crudo es poco soluble en el eluyente inicial (C6:AC 5:95) se opta por la inyección por carga seca (Dry-Load) a razón de 150mg de crudo sobre 200 mg de Celita. El resultado de la purificación se muestra en el cromatograma FLASH siguiente (Instrumento puriFlash PF-5.050):

Purificación en las condiciones descritas. Siguiendo la estrategia adecuada se ha incrementado la eficacia de la separación (compuestos puros que no requieren una segunda purificación) y una mayor velocidad (menor uso de solventes, costes operativos menores).

Conclusiones

Comparando los dos resultados se puede concluir que:

Resultados con puriFlash PF-5.050 y columna SiO2 PF-30HP/25g de 30μm.

Resultados con columna Redisep de 4g y equipo ISCO CombiFlash.

• El uso de una adecuada estrategia previa a cualquier purificación permite obtener resultados eficaces en menor tiempo.
• Una columna más eficiente permite obtener API’s de mayor pureza.
• El resultado obtenido permite una mayor carga de crudo en la columna PF-30HP/25g.
• No es necesario volver a purificar las fracciones: ahorro de tiempo y solventes.
• Aunque se ha utilizado una columna de 25g frente a una de 4g, el consumo de eluyente fue similar (el caudal aplicado en la columna de 4g es excesivo). Sin embargo la necesidad de volver a purificar las fracciones implica un mayor gasto global de solventes y tiempo de usuario

PuriFlash^TM PF 5.050

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