Mapa de Péptidos por Cromatografía de Fase Inversa (RPC)
Original document:
SMART DigeProviding the Highest Retention Time and Peak Area Reproducibility for Maximal Confidence in Peptide Mapping Experiments
Mauro De Pra,1 Ken Cook,2 Mike Oliver,3 Carsten Paul,1
1 Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany
2 Thermo Fisher Scientific, Hemel Hempstead, United Kingdom
3 Thermo Fisher Scientific, Runcorn, United Kingdom
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Introducción
La Cromatografía de Fase Inversa (RPC) de péptidos permite a la industria biofarmacéutica obtener información sobre la naturaleza y calidad de las proteínas terapéuticas. La Cromatografía de Fase Inversa en combinación con detección UV es de uso común en estudios de estabilidad, control de procesos, control de calidad y otros casos en los que los atributos importantes de la secuencia de péptidos se extrapolan directamente del cromatograma.
En éste último caso, la asignación de un péptido a un pico se basa en la comparación del tiempo de retención entre la muestra investigada y la de referencia, siempre que la identidad de los compuestos de el cromatograma de referencia haya sido determinada previamente por Espectrometría de Masas (LCMS).
Puesto que la asignación de la identidad de un pico se basa únicamente en el tiempo de retención resulta necesaria una extrema precisión análisis a análisis para evitar identificaciones incorrectas. El uso de protocolos de digestión lentos (a veces 24 horas) y potencialmente poco reproducibles puede complicar todavía más la identificación, ya que tienen un elevado potencial de modificaciones post-translacionales (PTM) y autolisis, que causan variaciones en el perfil del cromatograma.
Los kits de digestión Thermo Scientific™ SMART Digest™ con su diseño basado en tripsina inmovilizada térmicamente estable, permiten eliminar estos inconvenientes al proporcionar un proceso de digestión mucho más simple, con digestiones rápidas, muy reproducibles y de alta sensibilidad en comparación con los métodos tradicionales.
Proceso SMART
El Kit SMART Digest es la vía simple para implementar y satisfacer esas demandas y ofrece beneficios significativos sobre los protocolos convencionales existentes de digestión en solución:
- Significativamente más rápido
- Protocolo de preparación de muestras de 3 etapas
- Mayor productividad
- Automatizable
- Mayor reproducibilidad
- Superior sensibilidad
Los protocolos de preparación de muestras para la digestión de proteínas son laboriosos y complicados: se producen errores, poca reproducibilidad y baja velocidad.
El Kit SMART Digest supera esas barreras con un método de simple implementación de tres etapas (ver Figura 1) que ofrece seguridad en los datos, superior reproducibilidad y automatización.
Figura 1. Protocolo de Digestión Clásico frente a SMART Digest
Digestión completa en 60 minutos
SMART Digest no es sólo simple, además reduce significativamente el tiempo necesario desde la preparación de la muestra hasta el análisis: típicamente menos de 60 minutos, en función de la complejidad de la muestra como se ve en una muestra de lgG (ver Figura 2 y Figura 3).
Figura 2. La digestión completa se obtiene en menos de 60′ con SMART Digest
Figura 3. Protocolo convencional vs SMART Digest
Reproducibilidad
El Kit SMART Digest mejora sensiblemente la reproducibilidad en comparación con los protocolos existentes, con el resultado de menores pérdidas de muestra, mayor rendimiento y la habilidad de obtener datos más consistentes.
El cromatograma siguiente muestra 13 registros superpuestos de páptidos mAb de ratón, extraídos de plasma humano y procesados con el Kit SMART Digest y analizados con un equipo UHPLC Vanquish con bombas de pulsación muy baja que permiten la generación de un caudal extremadamente estable y la formación de gradientes muy precisos. La columna utilizada, Acclaim RSLC 120 C18, 2.2μm de 2.1x250mm, genera la alta resolución requerida por el método
Figura 4. 13 registros superpuestos de péptidos de mAb de ratón.
Tabla 1. RT-RSD (%)
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Más Información
Visite las siguientes entradas si desea más información sobre las nuevas columnas para biocromatografía de Thermo Scientific:
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- Determinación de la Concentración de mAb por Cromatografía de Afinidad)
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Advion e Interchim se han unido recientemente. Obtenga más información sobre los beneficios de la espectrometría de masas combinada y la cromatografía Flash en su nota de prensa: https://www.advion.com/advion-interchim-combination/
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