Purificación de Péptidos Bioactivos de Mezclas Complejas con puriFlash® 5.250 LC-Prep y expression® CMS
Original whitepaper:
Purification of Bioactive Peptides from Complex Mixtures using the puriFlash® 5.250 PrepLC and expression® CMS Detector
Author: Changtong Hao
Advion Interchim Scientific
Introducción
En los últimos años, las compañías biofarmacéuticas han adoptado cada vez más medicamentos basados en péptidos/proteínas debido a su mayor especificidad y selectividad en comparación con los medicamentos tradicionales de pequeñas moléculas. Sin embargo, la purificación de péptidos/proteínas durante el proceso de descubrimiento de medicamentos es crucial para garantizar la seguridad y eficacia del producto final. Alcanzar los niveles más altos posibles de pureza para los compuestos bioactivos es esencial para minimizar el riesgo de toxicidad y cumplir con las normas regulatorias.[1,2]
El aislado de proteína de suero, un subproducto de la producción de queso, contiene varios glicomacropéptidos y dos péptidos bioactivos significativos, el macropéptido de caseína A (CMPa) con un peso molecular (PM) de 6757 Da y el macropéptido de caseína B (CMPb) con un PM de 6787 Da. Extraer y purificar componentes individuales, como el macropéptido de caseína, es esencial para investigar su bioactividad.[3]
En esta nota de aplicación, utilizamos aislado de proteína de suero y dos macropéptidos de caseína como ejemplo para demostrar la aislamiento y purificación de componentes bioactivos con un sistema compuesto por un LC-Prep puriFlash® 5.250P acoplado en línea a un detector expression® CMS. Esta combinación ofrece una mayor selectividad y sensibilidad en comparación con los detectores tradicionales como UV o ELSD, que pueden no responder eficazmente a los péptidos y proteínas bioactivos.
Instrumentación
Figura 1. AIS AVANT® (U)HPLC
Figura 2. AIS puriFlash® 5.250P y expression® CMS
Tratamiento de la Muestra
Preparación de Aislado de Proteína de Suero
El procedimiento de aislamiento de la macropéptido de caseína utilizado en esta aplicación se basa en el trabajo de Tadao Saito[4] con algunas modificaciones.
- Se combinó una muestra de 50 g de aislado de proteína de suero comprada en una tienda de comestibles local con 500 mL de una mezcla de Agua:Metanol 70:30 70% (v/v). La mezcla se trató con ultrasonidos a 70°C durante 90 minutos y luego se filtró a presión reducida.
- El filtrado resultante se concentró a un volumen de 300 mL eliminando el metanol mediante un evaporador rotativo a presión reducida a 40°C y se almacenó a 4°C durante una hora. Posteriormente, se añadió un volumen igual de etanol frío a la solución, y la mezcla se trató por vórtex durante 5 minutos antes de almacenarse a 4°C durante 4 horas adicionales.
- La mezcla se filtró a presión reducida utilizando un filtro de 0.5 μm. El filtrado final se concentró a un volumen de 50 mL utilizando un evaporador rotativo a presión reducida.
- Se mezcló una alícuota de 100 μL del extracto concentrado con 900 μL de agua desionizada (DI) para análisis mediante HPLC/MS analítico.
- El filtrado restante se utilizó para la purificación de péptidos utilizando el sistema puriFlash® 5.250P acoplado con un detector expression® CMS.
Configuración del Método Analítico HPLC/MS
Tabla 1. Configuración del Método Analítico HPLC/MS
El procedimiento de aislamiento de la macropéptido de caseína utilizado en esta aplicación se basa en el trabajo de Tadao Saito[4] con algunas modificaciones.
- Se combinó una muestra de 50 g de aislado de proteína de suero comprada en una tienda de comestibles local con 500 mL de una mezcla de Agua:Metanol 70:30 70% (v/v). La mezcla se trató con ultrasonidos a 70°C durante 90 minutos y luego se filtró a presión reducida.
- El filtrado resultante se concentró a un volumen de 300 mL eliminando el metanol mediante un evaporador rotativo a presión reducida a 40°C y se almacenó a 4°C durante una hora. Posteriormente, se añadió un volumen igual de etanol frío a la solución, y la mezcla se trató por vórtex durante 5 minutos antes de almacenarse a 4°C durante 4 horas adicionales.
- La mezcla se filtró a presión reducida utilizando un filtro de 0.5 μm. El filtrado final se concentró a un volumen de 50 mL utilizando un evaporador rotativo a presión reducida.
- Se mezcló una alícuota de 100 μL del extracto concentrado con 900 μL de agua desionizada (DI) para análisis mediante HPLC/MS analítico.
- El filtrado restante se utilizó para la purificación de péptidos utilizando el sistema puriFlash® 5.250P acoplado con un detector expression® CMS.
Figura 3. (a) Cromatograma HPLC/MS del extracto líquido de aislado de proteína de suero, (b) Espectros MS promediados del pico en RT 6,44 min, (c) Masa deconvolucionada, no cargada, del pico de elución del péptido en RT 6,44 min
Figura 4. (a) Cromatograma HPLC/MS del extracto líquido del aislado de proteína de suero, (b) Espectros MS promediados del pico a RT 11.02 min, (c) Masa deconvolucionada y sin carga del péptido que eluye a RT 11.02 min.
Los espectros MS promediados obtenidos del pico que eluye a 11.02 min sugieren que el compuesto es también un péptido con múltiples cargas, con masas en m/z 751.5, 845.4, 966.1, 1126.8 y 1352.1 (Figura 4b) formando su perfil de carga.
De manera similar, la deconvolución de la carga determina que la masa sin carga de este péptido es de 6755.3 Da, lo que indica la variante A del macropéptido de caseína, CMPa, con una masa teórica de 6755 Da (Figura 4c).
Configuración del Método de Purificación LC-Prep/MS
Tabla 2. Configuración del Método de Purificación LC-Prep/MS
En un paso siguiente, el método de separación analítica se trasladó a una escala de preparación mayor, de una columna con un diámetro interno de 4,6 mm a una con un diámetro interno de 30 mm y se optimizó aún más para la purificación de los dos CMP’s (caseinoglicomacropéptidos) en el sistema LC-Prep/Flash puriFlash® 5.250P acoplado en línea al detector expression® CMS.
El cromatograma LC-Prep UV/MS del aislado de proteína de suero se muestra en la Figura 5 y los parámetros se presentan en la Tabla 2.
La recolección de fracciones se desencadenó con base en la señal de MS, elegida por su mayor selectividad y sensibilidad. Se utilizó XIC de 970-971 Da para detectar CMPb, y XIC de 965-966 Da para CMPa.
El disolvente orgánico en la combinación de las fracciones 11-17 y la fracción 18-22 se eliminó utilizando un evaporador rotativo bajo presión negativa, y la solución acuosa restante se secó usando un liofilizador LABCONCO Freezone 2.5L (-50 °C), resultando en una recolección seca de 10 mg cada una, que luego se disolvieron en 10 ml de agua desionizada para el análisis posterior por HPLC/UV/MS. Los resultados del análisis de pureza se muestran en las Figuras 6 y 7.
Figura 5. Cromatograma LC-Prep UV/MS de dos aislados de proteína de suero
Análisis de la Pureza de CMBp
El análisis de pureza de CMPb en las fracciones agrupadas del 11 al 17 se muestra en la Figura 6.
El análisis por MS muestra que se detectaron cuatro iones principales con m/z de 970.8, 1132.3, 1358.6 y 1968.2 (Figura 6b). Con los espectros de masas promediados de la Figura 6b, se determinó que la masa sin carga del pico a los 5.94 minutos fue de 6788.4 (CMPb, Figura 6c). Sin embargo, el análisis por MS también puede detectar cuatro componentes menores en 6758.3, 6773.5, 6804.8 y 6868.4 Da.
La pureza UV obtenida de CMPb es del 86.7% (Figura 6d), pero, basándose en los datos adicionales de MS, la pureza del compuesto es en realidad menor (estimada en 80%).
La pureza UV obtenida de CMPa en las fracciones agrupadas del 18 al 22 es del 94.7% (Figura 7a) según el análisis UV de la corrida analítica. El análisis de masa sin carga desconvolucionada muestra la masa dominante esperada de 6756.2 de CMPa (Figura 7b), y un componente menor en 6774.6, una forma oxidada de CMPa.
Nuevamente, este ejemplo muestra el valor de la detección por MS de compuestos bioactivos como péptidos y proteínas, y la mejor especificidad de la detección por MS en comparación con UV.
Figura 6. (a) El cromatograma HPLC-MS de las fracciones agrupadas de 11-17, (b) Espectros MS promediados del pico que eluye a un RT de 5.94 min, (c) la masa sin carga de (b), (d) El cromatograma HPLC-UV de las fracciones agrupadas de 11-17.
Figura 7. (a) El cromatograma HPLC-UV de las fracciones combinadas de 18-22. (b) masa sin carga deconvolucionada de CMPa.
La pureza final general se estima en aproximadamente 90%, un valor excelente para una molécula bioactiva en el descubrimiento de fármacos.
Se puede lograr una mayor mejora en la pureza con fracciones selectivas, a costa del rendimiento.
Por ejemplo, el análisis HPLC-UV/MS de la fracción 20 de CMPa (Figura 8a) muestra una pureza UV del 99.0% (Figura 8d) y ningún subproducto oxidado en el análisis MS.
Figura 8. (a) Cromatograma HPLC-MS de la fracción 20, (b) Espectros MS promediados del pico a un tiempo de retención de 5.71 min, (c) Masa sin carga deconvolucionada de CMPa, (d) Cromatograma HPLC-UV de las fracciones 20.
Conclusión
El sistema LC-Prep/Flash puriFlash® 5.250P, acoplado en línea con un detector expression® CMS, logra un rendimiento sobresaliente, facilitando la purificación selectiva de macropéptidos bioactivos de una matriz compleja con un alto nivel de confianza.
En comparación con los detectores UV o ELSD, el espectrómetro de masas ofrece una selectividad y sensibilidad superiores.
Una aplicación ilustrativa de este enfoque muestra el aislamiento de glicomacropéptidos de caseína, resultando en un rango de pureza del 80% (CMPb) al 90% (CMPa) a través de fracciones combinadas con alto rendimiento.
Se puede lograr una pureza aún mayor de hasta el 99.0% con fracciones selectivas.
REFERENCIAS
[1]Gräslund, S., et al. (2008). Protein production and purification. Nature methods, 5(2), 135-146.
[2]Biopharmaceutical Processing: Development, Design, and Implementation of Manufacturing Processes.
[3]Lin T., et al. (2021) Bioactives in bovine milk: chemistry, technology, and applications Nutrition Reviews v79(S2):48–69
[4]Saito T., er al. (1991) A new isolation method of caseinoglycopeptide from sweet cheese whey. J. Dairy Sci. 74, 2831-2837
Advion e Interchim se han unido recientemente. Obtenga más información sobre los beneficios de la espectrometría de masas combinada y la cromatografía Flash en su nota de prensa: https://www.advion.com/advion-interchim-combination/
Cómo contactar con Cromlab
Para cualquier información adicional u oferta de productos contacte con nuestro Departamento Comercial.
