Cómo optimizar una Purificación en FLASH

1. Desarrollar una Estrategia Previa

Los Métodos de Purificación en Cromatografía FLASH, y especialmente en UPFP (Ultra Performance Flash Purification) se desarrollan, o deberían desarrollarse, con los datos obtenidos en separaciones previas en Cromatografía de Capa Fina (TLC) y seguir los pasos siguientes:

• Generar una mezcla binaria que permita que los compuestos de interés estén comprendidos entre Rf 0.15 y Rf 0.35 para una separación óptima
• Optimizar la separación modificando la fuerza y/o la selectividad del eluyente
• Aumentar la velocidad transformando un método Isocrático a Gradiente

Normalmente los datos generados en TLC se expresan en términos de Retención (Rf) que se mide por la relación entre la distancia recorrida por el compuesto y el frente del solvente,  mientras que en purificaciones en columna se mide la retención en función de Volumen de Columna (CV) que generalmente se define como el volumen de solvente necesario para mover los componentes a lo largo de la columna.

La relación siguiente permite transferir los datos obtenidos en TLC a los términos usados en FLASH:

CV=1/Rf

De esta relación se deduce que un valor de Rf menor corresponde a un mayor valor de CV que, a su vez, indica un mayor tiempo de interacción entre el compuesto de interés y el material del lecho de la columna.

Una vez obtenida una separación adecuada (los compuestos de interés han de estar comprendidos entre Rf 0.15 y Rf 0.35 para una separación óptima) es posible trasponer un método desarrollado en TLC y en condiciones isocráticas a un método UPFP en condiciones de gradiente.
Supongamos los casos siguientes de la Figura 1:

Figura 1. Aumentando la fracción polar (Acetato de Etilo) del eluyente aumentan los valores de Rf, pero, al mismo tiempo, disminuye el DCV relativo, disminuyendo la resolución.

• Caso 1. Heptano:Acetato de Etilo 9:1. Compuestos de interés en el intervalo Rf entre 0.15 y 0.35. RfA=1.25/5.50=0.227, CVA=1/0.227= 4.4. RfB=1.01/5.50=0.183, CVB=1/0.227= 5.5. ΔCV=5.5-4.4=1.1
• Caso 2.  Heptano:Acetato de Etilo 8:2. Compuestos de interés en el intervalo Rf entre 0.15 y 0.35.  RfA=2.04/5.50=0.371, CVA=1/0.371= 2.7. RfB=1.64/5.50=0.298, CVB=1/0.298= 3.3. ΔCV=3.3-2.7=0.6
• Caso 3.  Heptano:Acetato de Etilo 7:3. Compuestos de interés fuera del intervalo Rf entre 0.15 y 0.35. RfA=3.28/5.50=0.596, CVA=1/0.596= 1.7. RfB=2.51/5.50=0.456, CVB=1/0.456= 2.2. ΔCV=2.2-1.7=0.5
• Caso 4.  Heptano:Acetato de Etilo 6:4. Compuestos de interés fuera del intervalo Rf entre 0.15 y 0.35. RfA=4.46/5.50=0.811, CVA=1/0.811= 1.2. RfB=3.51/5.50=0.638, CVB=1/0.638= 1.6. ΔCV=1.6-1.2=0.4

Los cromatogramas en FLASH, con los eluyentes aplicados en las TLC, se muestran en la Figura 2:

Figura 2. Un mayor DCV implica mayor interacción soluto/fase. El tiempo de retención y la resolución aumentan.

Una separación con ΔCV alto indica una mejor separación en UPFP o, como alternativa, una superior capacidad de carga.

Este otro ejemplo ilustra como conviene operar con un ΔCV alto:

Figura 3. Estas separaciones en TLC muestran que la separación 9:1 ofrece un DCV máximo entre Rf 0.15 y 0.35

Figura 4. con un DCV de 2.8 (Rango Normal Verde) se requiere una columna más pequeña que sil el DCV es de 1.1 (Rango Difícil Amarillo)

2. Modificar Fuerza del Eluyente: un concepto básico muy útil en FLASH

Si la modificación de la concentración de los componentes de una mezcla binaria no logra el objetivo de obtener una separación de los componentes de un crudo en el intervalo entre Rf 0.15 y Rf 0.35 usar otros eluyentes con fuerza similar para modificar la selectividad puede ser el camino a seguir.

La Figura 5 muestra el llamado “Triángulo de Selectividad”. Este gráfico permite al técnico conseguir un cambio en la selectividad del solvente de un modo mucho más rápido que con una selección aleatoria.

Figura 5. Siempre que sea posible, para optimizar la selectividad, se deberían usar mezclas con hexano y Acetato de Etilo (G6), Cloruro de Metileno (G5), Tolueno (G7), THF (G3) y Éter Etílico (G1). Estas combinaciones generan un amplio rango de selectividad y permiten definir la mejor opción para decidir los eluyentes más adecuados para UPFP.

La Tabla 1 muestra las características principales de los eluyentes usados en UPFP y el grupo al que pertenecen. En la tabla se especifican las longitudes de onda aproximadas en nm, por debajo de las cuales la absorbancia del solvente puede resultar inaceptable.

Tabla 1. Características Físico-Químicas de los principales eluyentes usados en Cromatografía FLASH.

En trabajos cuantitativos la longitud de onda (L₀) puede fijarse de tal manera que el valor de la absorbancia en una celda de 10mm sea 0.05 UA (relativa al agua, A_1cm>0.05). En trabajos cualitativos, se puede trabajar a longitudes significativamente menores y la mayoría de los técnicos aceptan un valor de corte basado en 1UA (L₁, relativa al agua, A1cm>1.0). Sin embargo si la curva de absorción sube fuertemente, puede que el rango de longitudes de onda disponibles no sea muy amplio.

Como ejemplo tomemos las placa siguientes, Figuras 6 y 7 , donde

A = Producto A, B = Producto A, C = CRUDO, A+B: Mix A+B:

3. Usar un Gradiente para aumentar la velocidad

En general se usa una primera aproximación como la mostrada en la Figura 9:

Figura 9. Gradiente inicial previo a la optimización.

La Tabla2 muestra la transposición de CV a RT para varias columnas FLASH desde 4 a 80g de SiO₂.

Tabla 2. Transposición de las Condiciones de Gradiente de la Figura 9 para columnas FLASH de diferente masa.

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Hasta hace pocos años los equipos destinados a purificaciones mediante Cromatografía de Baja Presión (FLASH) se diseñaban con el objetivo de ser simples y, en cierta medida, lo más económicos posible. El corazón del sistema es una bomba de muy alto caudal y baja presión.

Por otra parte los equipos LC-Prep eran la extensión lógica de los equipos de HPLC Analítica, con la salvedad de requerir bombas de mayor caudal y las altas presiones operativas, normalmente entre 150 y 400 bar y de coste muy elevado.

Por lo tanto hasta 2010-2011, el usuario que necesitaba purificar compuestos de síntesis o naturales tenía tres opciones:

1. Purificar en columna con la consiguiente pérdida de tiempo y baja resolución (recuperaciones bajas o pureza pobre). El diseño de la separación normalmente se hace por Transposición de resultados obtenidos en Cromatografía de Capa Fina (TLC). La técnica más usual es la FASE NORMAL (FN o NP).
2. Purificar en FLASH. Más rápido y eficiente que la purificación por gravedad con mejor recuperación y pureza. El método también se diseña por Transposición de TLC. La técnica más usual es la FASE NORMAL (FN o NP).
3. LC-Preparativa (LC-Prep, HPLC-Prep) para obtener la máxima pureza y eficacia posible. El diseño de la separación normalmente se hace por Transposición de resultados obtenidos en UPLC o HPLC. La técnica más usual es la FASE INVERSA (FI o RP).

A partir de 2011 Interchim introduce el concepto de UPFP (Ultra Performance Flash Purification), que estrecha las diferencias en prestaciones entre Cromatografía FLASH y LC-Prep.

UPFP se basa en el uso de columnas FLASH de superior calidad, de partícula esférica y menor diámetro (50, 30 y 15 µm) que permiten obtener prestaciones muy cercanas a LC- Prep pero con las ventajas de FLASH: velocidad, capacidad de carga y un sensible menor coste.

Figura 2. UPFP permite las grandes capacidades de carga de las columnas FLASH con resoluciones cercanas a LC-Prep

¿Que equipos hay en el mercado?

Básicamente parece que todo se ha estabilizado en tres grandes líneas:

• Equipos FLASH Estándar con prestaciones instrumentales suficientes para el químico orgánico de síntesis que no está muy versado en cromatografía. De hecho estos equipos se denominan «Purificadores» mientras que lo más correcto sería LPLC (Low Pressure Liquid Chromatography). El 90% de las separaciones se hacen en Fase Normal (sílice) que es el método más simple, especialmente en cuanto respecta a la eliminación del solvente. Los equipos FLASH trabajan a grandes caudales (10-200 mL/min) y bajas presiones (10-14 bar).
  Se basan generalmente en bombas binarias, que pierden eficacia a medida que se aumenta la viscosidad del eluyente (los caudales máximos prometidos sólo se alcanzan con eluyentes de FN, como Hexano o Acetato de Etilo, pero con H₂O o IPA pueden generar el 70 o 80% del caudal nominal).
• Equipos FLASH diseñados para UPFP.  Como en UPFP  las exigencias instrumentales son mayores (mayor presión y caudal máximo  sostenible en condiciones de Fase Inversa) las bombas ya son cuaternarias, y se diseñan como las de HPLC tradicional, para garantizar presiones más altas con solventes viscosos. Permiten el uso de columnas FLASH de Alta Resolución ( Fase de Partícula Esférica y tamaño de 30 o 15 μm). Algunos Equipos pueden tener la capacidad de usar columnas para LC-Prep (PF450), especialmente en condiciones de Fase Normal.
• Equipos LC-Prep, de prestaciones instrumentales mucho más altas y normalmente la elección del químico analista, más versado en cromatografía. Los caudales son medios (las columnas LC-Prep de gran diámetro son muy caras) y las presiones requeridas muy altas (al menos 100-150 bar). El 90% de las separaciones se hacen en Fase Inversa por transposición de métodos analíticos existentes.

Veremos en el apartado correspondiente, que bombas que generen presiones de 200 bar son más que suficientes para una purificación por LC-Prep en Fase Inversa (método que requiere más presión que los de Fase Normal).

Coste Operativo: ¿LC-Prep o UPFP?

Cuando hablamos del coste operativo hay que referirse tanto al gasto de eluyentes (de calidad estándar en UPFP, y de calidad HPLC en LC-Prep) como en el de columnas.

La Tabla 1 muestra las columnas más usadas en LC-Prep (15, 10 y 5 μm) y su equivalencia en UPFP (sólo 15 μm).

Tabla 1. Coste de columnas LC-Prep y UPFP. En negrita y cursiva las más usuales. Cuando se indican más de una columna éstas se usan en serie para simular la equivalente en LC-Prep. Por ejemplo 2 x F0025 corresponde a 2 columnas F0025 en serie, equivalente a  una columna de 334x28mm.

Dos columnas UPFP de Fase Inversa C18 (FI o RP) de 21 x 133mm y 15 µm cuestan unos 160€ y una equivalente en LC-Prep unos 1.300€. Como ambas se pueden reutilizar, una columnas UPFP cuesta 8 veces menos que la equivalente LC-Prep, y como veremos con resultados también equivalentes.

En el caso de las columnas UPFP de SiO2 (FN), en principio no se recomienda la reutilización, pero su bajo coste (35€ frente a 900€) permiten usar columnas nuevas en cada purificación, que redunda en mayor productividad y calidad.

La cuestión de la presión

En 2012 Interchim presenta la nueva serie de alta presión (PF4125 y PF4250) que aúna alto caudal (250 mL/min) y alta presión hasta 250 bar (125 bar en 4125). La disponibilidad de un caudal y presión alto permiten tanto técnicas FLASH como LC-Prep, tanto en Fase Normal como Inversa.

El panorama se presenta ahora como sigue:

Tabla 2. Equipos LC-Prep, FLASH, UPFP y LC-Prep/UPFP usuales.

La Tabla 2 muestra los equipos más usuales para LC-Prep, FLASH, UPFP y LC-Prep/UPFP disponibles en el mercado. Salvo algunas excepciones (equipos no especialistas) las presiones máximas generadas por las bombas no superan los 200-280 bar.

¿Son necesarios equipos con presiones de más de 200 bar?

En principio con columnas de partícula de 5 μm y longitud de 250mm, no se requieren bombas de más de 200 bar.

Con los programas de simulación necesarios (HPLC Simulator,  LC Calculator o Column Backpressures & Mass Loads Calculator), resulta fácil generar la Tabla 3 siguiente:

Tabla 3. Pérdida de carga con diferentes eluyentes a 25 ºC para una columna de 250×4.6m y partícula de 5, 10 y 15um

Se puede ver que en las condiciones más adversas (columna de 250mm de longitud, partícula de 5 μm MeOH:H₂O 50:50) se precisan 160 bar a 1 mL/min o 320 bar a 2 mL min.

La Tabla 4 muestra los caudales requeridos para una columna de diámetros entre 10 y 50 mm.

Tabla 4. Caudal necesario para mantener la misma velocidad lineal en columna.

Analicemos las siguientes Figuras 3, 4 y 5, en las que se muestra la Pérdida de Carga (presión necesaria) en presencia de agua (Fase Inversa o RP) para columnas de 5, 10 y 15 µm, a caudal nominal y caudal 2X con Acetonitrilo (menos viscoso pero caro) y Metanol (más viscoso pero más económico) en condiciones de gradiente.

Se puede ver que con un 50:50 de agua:orgánico (viscosidad máxima) las presiones alcanzan 160 bar (unos 80 con Acetonitrilo), 40 bar (20 bar con ACN) y de sólo 18 bar (8 bar con ACN) con columnas de 5, 10 y 15 µm respectivamente. Si se dobla el caudal para reducir el tiempo de retención se doblarán las presiones…

Figura 3. Pérdida de Carga en condiciones de Gradiente H2O:MeOH y H2O:ACN. Partícula 5 um.

Figura 4. Pérdida de Carga en condiciones de Gradiente H2O:MeOH y H2O:ACN. Partícula 10 um.

Figura 5. Pérdida de Carga en condiciones de Gradiente H2O:MeOH y H2O:ACN. Partícula 15 um.

De las figuras puede deducirse que en las condiciones adecuadas en purificaciones en Fase inversa (en Fase Normal las presiones requeridas son mucho menores (ver Tabla 3), como:

• Baja viscosidad (Acetonitrilo en lugar de Metanol)
• Tamaño de partícula razonable para una buena purificación (10, 15 μm
• Longitud de columna razonable (100, 150 mm)

¡Hasta un equipo de media presión como PF5.050, puede trabajar sin ningún problema con columnas para LC-Prep!

Las Figuras 6, 7 y 8 muestran que hasta con columnas de 15 μm se pueden efectuar purificaciones muy eficientes, y económicas ¡si se utilizan columnas UPFP de 15 μm!

Figura 6. Con columnas de 15 um se pueden conseguir buenas purificaciones tanto en LC-Prep como en UPFP.

Figura 7. Las columnas con partícula de 10 um mejoran la resolución y generan muy poca contra presión. Sólo disponibles en formato LC-Prep.

Figura 8. La máxima eficacia se obtiene disminuyendo el tamaño de partícula a costa de aumentar la pérdida de carga y el coste de la columna.

Otros efectos a tener muy en cuenta